棉籽酶解蛋白對奶牛瘤胃液體外發酵參數及微生物區系的影響

趙亞波 張騰龍 張艷梅 白 晨 敖長金

(內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區高校動物營養與飼料科學重點實驗室，呼和浩特010018)

瘤胃微生物以及瘤胃內環境的穩恒在反芻動物對飼糧營養物質的消化過程中起著重要作用。飼糧中的蛋白質進入奶牛瘤胃后，70%能夠被微生物所消化，其余30%進入真胃和小腸等部位進行消化。大部分飼糧中蛋白質被瘤胃微生物轉化為微生物蛋白，其品質較優質蛋白質差，使飼糧中優質蛋白質的利用率降低。在奶牛飼糧中添加非蛋白氮會為瘤胃微生物合成微生物蛋白提供氮源，從而能夠提高過瘤胃蛋白含量，有利于優質蛋白質在小腸段被消化吸收，進而提高其利用率。但是，非蛋白氮的使用需要注意諸多問題，如需添加能量飼料、配合粗蛋白質使用和防止氨中毒等。因此，探尋安全、有效的新型飼料添加劑有利于奶牛對飼糧中優質蛋白質的吸收利用，提高飼料轉化率，改善乳品質。

小肽(SP)通常是指由2～3個氨基酸組成的寡肽，具有轉運速度快、耗能低和不易飽和等特點，比單一氨基酸更容易被機體組織吸收和利用。因為小肽可被反芻動物機體完全吸收，對反芻動物自身的蛋白質營養具有重要意義，所以，小肽在反芻動物生產中的應用逐漸增多。司丙文等在奶牛飼糧中分別添加5、10和15 g/(頭·d)小肽，結果表明，添加10 g/(頭·d)小肽效果最佳，能夠顯著提高奶牛的產奶性能和氮的表觀消化率。涂瑞等發現在不同精粗比飼糧條件下添加小肽對體外產氣量、養分降解率和發酵參數有顯著影響。張智安等研究表明，在湖羊飼糧中添加蜜蜂肽能夠增加瘤胃微生物群落豐富度和多樣性，同時抑制革蘭氏陰性菌生長與繁殖，促進瘤胃發酵模式趨于乙酸發酵，提高乙酸/丙酸值。綜上所述，目前關于小肽對瘤胃發酵的調控還鮮有報道，尤其是對奶牛瘤胃微生物區系的影響的報道更少。棉籽酶解蛋白是以優質的植物蛋白質為原料，經組合液態酶酶解工藝生產的小肽產品，該產品對奶牛瘤胃發酵有無影響還需進一步研究。因此，本試驗主要通過體外批次培養法，旨在研究棉籽酶解蛋白對奶牛瘤胃發酵和微生物區系的影響，為該產品作為飼料添加劑在奶牛養殖中的進一步應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用棉籽酶解蛋白是通過植物蛋白酶解得到的功能肽產品，總蛋白質含量在45%以上，其中小肽含量為28%(谷氨酸含量9.55%、天冬氨酸含量4.20%、精氨酸含量4.47%、賴氨酸含量2.86%、亮氨酸含量2.76%、甘氨酸含量2.27%和苯丙氨酸含量2.27%)，由成都某公司提供。

1.2 試驗設計

選取4頭健康、體況和泌乳天數相近的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，每天07：00和18：00飼喂和擠奶，飼糧精粗(干物質基礎)比為50∶50，其組成及營養水平如表1所示。體外發酵底物與供體奶牛飼糧水平相同，粉碎后過1 mm篩。本試驗采用單因素隨機試驗設計，將采集的瘤胃液混勻后分為4組，即對照組(C組)、低濃度組(E組)、中濃度組(F組)和高濃度組(G組)，并分別在其底物中添加0、0.3%、0.5%和0.7%的棉籽酶解蛋白(干物質基礎)，每組每個時間點3個重復，體外發酵培養48 h，分別在2、4、6、8、12、24和48 h進行樣品采集，每次3個重復全部采集瘤胃上清液。

表1 飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 體外瘤胃發酵培養

1.3.1 瘤胃液采集及瘤胃緩沖液的配制

瘤胃液采集：本試驗選取4頭健康、體況和泌乳天數相近的荷斯坦奶牛，于07：00進行晨飼，11：00采用口腔采集法收集瘤胃液，每頭牛收集800 mL瘤胃液[10]。將采集的瘤胃液均勻混合后經4層紗布過濾后，倒入用熱水預熱和充有二氧化碳的保溫瓶中，帶回實驗室。

瘤胃液緩沖液參照Menke等[11]的方法制備：400 mL蒸餾水、200 mL A液(39 g NaHCO3和2 g NH4HCO3溶于1 L蒸餾水)、0.1 mL B液(13.2 g CaCl2·2H2O、10 g MnCl2·4H2O、1 g CoCl2·6H2O、8 g FeCl3·6H2O溶于100 mL蒸餾水)、200 mL C液(5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O溶于1 L蒸餾水)、1 mL刃天青溶液以及40 mL還原劑溶液(95 mL蒸餾水、4 mL NaOH和0.625 g Na2S·9H2O)。在與瘤胃液混合前加入還原劑溶液并置于39 ℃水浴鍋中并持續通入二氧化碳直至混合液顏色變淡或無色時即可使用。

1.3.2 體外發酵培養與樣品采集

采用瓶口向上且蓋有橡膠塞的250 mL玻璃瓶作為人工瘤胃培養瓶。試驗前，將精確稱取的2.00 g基礎培養底物放入人工瘤胃培養瓶中，C組、E組、F組和G組分別加入0、6.00、10.00和14.00 mg棉籽酶解蛋白。參照Menke等[12]的體外培養方法，將過濾后的瘤胃液與配制好的緩沖液按照1∶2的比例混勻于持續通入二氧化碳的三角瓶中，制成人工瘤胃培養液，三角瓶置于39 ℃水浴中。抽取200 mL人工瘤胃培養液分裝于預熱至39 ℃并通有二氧化碳的培養瓶中，蓋緊瓶塞，放入39 ℃水浴搖床上開始厭氧培養。將玻璃瓶的2/3浸于控溫水浴搖床中，搖床頻率為40 r/min。試驗過程中，每30 min進行1次排氣，培養時間48 h。

在體外發酵培養過程中，分別在2、4、6、8、12、24和48 h取出3瓶，停止發酵。取出的樣品使用EL20型酸度計測定培養液pH后，分為3部分：一部分取5 mL瘤胃液裝在含有2 mL 25%偏磷酸的10 mL離心管中，-20 ℃保存，用于測定瘤胃液揮發性脂肪酸(VFA)濃度；一部分放到10 mL離心管中，-20 ℃保存，用于測定瘤胃液中氨態氮(NH3-N)和菌體蛋白(MCP)濃度；一部分裝在50 mL離心管中，-80 ℃保存，用于后期瘤胃微生物DNA的提取和測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 飼料常規指標的測定

飼糧中粗蛋白質含量使用凱氏定氮法測定(GB/T 6432—2018)；粗脂肪含量使用濾袋法測定(GB/T 6433—2006);粗灰分含量按照國家標準GB/T 6438—2007進行測定；酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量采用范氏(Van Soest)[13]洗滌纖維分析法測定；鈣和磷含量分別使用高錳酸鉀法(GB/T 6436—2002)和鉬黃分光光度法(GB/T 6437—2002)測定。

1.4.2 瘤胃內環境指標的測定

樣品解凍后5 000×g離心10 min，收集上清液，用氣相色譜法測定VFA濃度[14]。NH3-N濃度采用靛酚比色法測定[15]。MCP濃度使用考馬斯亮藍法測定[16]。

1.4.3 瘤胃微生物的測定

解凍瘤胃液樣品，采用TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒[天根]生化科技(北京)有限公司〗提取DNA，具體操作參考說明書步驟。用分光光度計測定DNA樣品的濃度與OD260/OD280值；取5 μL DNA樣品進行2%的瓊脂糖凝膠電泳并拍照，檢測DNA的完整性和質量。

以提取的瘤胃液總微生物DNA為模板，檢測瘤胃黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、反芻月形單胞菌、布氏普雷沃氏菌、易北普雷沃氏菌、總細菌絕對含量變化。各細菌的擴增引物序列如表2所示。參考王堯悅[17]的方法計算各樣品中每種細菌的拷貝數。熒光定量PCR反應體系如表3所示，反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環；熒光信號采集設置在60 ℃(每循環第2步反應時)。

表2 引物序列

表3 熒光定量PCR反應體系

1.5 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2019軟件進行整理，并運用SPSS 24.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行各組間的顯著性比較，并使用Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示，顯著水平為P<0.05。

2 結 果

2.1 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵的影響

2.1.1 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液pH的影響

由表4可知，在整個培養過程中，瘤胃發酵液pH均處于正常水平之中。在體外培養的8 h以內，各組的pH均顯著低于對照組(P<0.05)；當培養8～48 h，除24 h的E組pH高于對照組外，其他各時段試驗組的pH均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液pH的影響

2.1.2 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液NH3-N濃度的影響

由表5可知，隨著培養時間的增加，各組NH3-N濃度均呈現先下降后上升的趨勢。當培養8 h后，各試驗組瘤胃發酵液中NH3-N濃度明顯上升，24～48 h則趨于平緩。在培養2～12 h，各組瘤胃發酵液中NH3-N濃度均顯著低于對照組(P<0.05)；在培養24和48 h時，F組瘤胃發酵液中NH3-N濃度均顯著高于其他3組(P<0.05)。除在2 h，F組和G組之間差異不顯著(P>0.05)外，其余各時間段各組之間NH3-N濃度均呈差異顯著(P<0.05)。

表5 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液NH3-N濃度的影響

2.1.3 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液MCP濃度的影響

由表6可知，在整個培養過程中，各組瘤胃液中MCP濃度均呈先上升再下降，再上升，再下降的趨勢；在培養2～8 h，對照組MCP濃度呈上升狀態，之后趨于平緩。在各時間點，與對照組相比，各試驗組瘤胃發酵液中MCP濃度顯著升高(P<0.05)；除2、12和24 h外，G組在各時間點瘤胃發酵液中MCP濃度顯著高于其他組(P<0.05)。

表6 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中MCP濃度的影響

2.1.4 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液VFA濃度的影響

由表7可知，在整個培養過程中，各試驗組總揮發性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸濃度和乙酸/丙酸均呈先急劇上升，后緩慢上升趨勢。各試驗組之間TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度在各時間段內均呈差異顯著(P<0.05)；其中，C組和G組的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度均在較高水平波動，顯著高于E組和F組(P<0.05)；各時間點的E組和F組乙酸/丙酸總體上顯著低于對照組和G組(P<0.05)。

表7 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中VFA濃度的影響

續表7項目Items時間Time/h組別 GroupsCEFGSEMP值P-value丙酸Propionate/(mmol/L)212.74c8.54a17.05d9.73b0.0690.011417.38d12.42c11.94b9.15a0.0660.011618.51d12.36a15.84c15.41b0.0800.012820.29c18.24a19.10b23.79d0.0600.0051219.18c10.60a19.24d17.13b0.0600.0062424.38c15.10a16.82b25.94d0.0770.0054821.75d19.22b16.18a21.25c0.0690.015丁酸Butyrate/(mmol/L)28.36c6.21a11.07d6.43b0.0770.01349.61d9.23c8.34b6.53a0.0870.013610.04b9.18a10.74d10.31c0.1980.011812.13a14.22c12.62b15.87d0.0560.0181210.94b9.69a13.48d13.06c0.0490.0062419.87c11.68a15.37b26.38d0.0370.0144816.25d15.91c12.38a15.45b0.0620.013乙酸/丙酸Acetate/propionate22.50c2.59c2.28a2.40b0.0230.02442.14a2.63c2.38b2.30b0.0370.01462.42b2.91c2.26a2.40b0.0640.00782.16a2.55b2.58b2.57b0.2030.032122.92d2.01a2.46b2.57c0.0720.007242.85d2.64c1.78a2.21b0.0320.012482.49c2.03a2.23b2.87d0.1030.012

2.2 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液微生物區系的影響

2.2.1 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液普雷沃氏菌數量的影響

由表8可知，在整個培養過程中，布氏普雷沃氏菌數量呈平緩式下降，易北普雷沃氏菌數量呈波動式下降；F組布氏普雷沃氏菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)，E組布氏普雷沃氏菌數量顯著低于對照組(P<0.05)；G組布氏普雷沃氏菌數量在2～12 h培養過程中顯著低于對照組(P<0.05)。在培養2 h時，F組易北普雷沃氏菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)，而E組易北普雷沃氏菌數量顯著低于對照組和G組(P<0.05)；在培養8 h時，G組易北普雷沃氏菌數量顯著低于其他3組(P<0.05)；在培養24 h時，E組易北普雷沃氏菌數量顯著低于其他3組(P<0.05)；在培養48 h時，F組和G組易北普雷沃氏菌數量顯著高于對照組和E組(P<0.05)。

表8 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中普雷沃氏菌數量的影響

2.2.2 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液反芻獸新月形單胞菌數量的影響

由表9可知，在整個培養過程中，各試驗組反芻獸新月形單胞菌數量的變化趨勢相似，在培養2～4 h呈下降趨勢，在4～6 h急劇上升，之后趨于平緩趨勢。在培養2～6 h，F組反芻獸新月形單胞菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)；各時間點G組反芻獸新月形單胞菌數量顯著低于其他3組(P<0.05)。

表9 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中反芻新月形單胞菌數量的影響

2.2.3 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中瘤胃球菌數量的影響

由表10可知，在整個培養過程中，各試驗組的黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數量變化趨勢大體相同；黃色瘤胃球菌數量呈先增加后降低趨勢，白色瘤胃球菌數量呈平緩上升趨勢。各個時間點F組的黃色瘤胃球菌數量和白色瘤胃球菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)。

表10 棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數量的影響

續表10時間Time/h組別 GroupsCEFGSEMP值P-value4817.28a17.56b17.87c17.57b0.070.012白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus214.53a15.05b15.66c15.56c0.130.013414.70a15.76b15.90b15.68b0.140.009614.74a15.91b15.93b15.97b0.150.011815.39a16.27c16.45d16.05b0.120.0121215.07a15.97c16.33d15.84b0.130.0012416.00a16.42b16.42b16.04a0.060.0034815.88a15.94ab16.15c15.75a0.050.011

3 討 論

3.1 棉籽酶解蛋白對奶牛瘤胃發酵參數的影響

瘤胃液pH是評價瘤胃發酵狀況的一項重要指標，其數值主要在5.5～6.8變化，呈現中性或弱酸性[18]。瘤胃是瘤胃微生物發酵的主要場所，pH過高或過低可直接影響瘤胃微生物的生長代謝，同時還可以反映反芻動物瘤胃內發酵和有機酸的代謝情況。在本試驗中，各組瘤胃發酵液pH均在6.31～6.74變化，表明本試驗條件下能夠保證瘤胃微生物正常生長代謝。在培養2～8 h，各組pH顯著低于對照組，而在培養12～48 h，各試驗組之間pH沒有顯著差異。王夢芝等[19]使用4種形式的氮源底物研究其對山羊瘤胃發酵的影響，結果顯示pH呈現降低趨勢，與本試驗結果一致，說明小肽能夠促進瘤胃中碳水化合物的發酵，使VFA生成增多。

瘤胃液中NH3-N濃度是瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質和內源性含氮物質降解的重要產物。瘤胃中NH3-N濃度處于一個動態平衡狀態，經常受到氮攝入、飼糧蛋白質降解、MCP合成速率和瘤胃對NH3-N的吸收等因素影響[20]。在本試驗中，各組瘤胃液NH3-N濃度顯著低于對照組，表明添加棉籽酶解蛋白可以增加微生物對氨氮的利用。殷云浩[21]和Jones等[22]研究發現，添加小肽可顯著降低瘤胃液中NH3-N濃度，與本試驗研究結果一致。當瘤胃液NH3-N濃度為8.5 mg/dL時，瘤胃微生物合成蛋白質的能力達到飽和，即使超過這一濃度，MCP產量不再增加[23]，而過高的NH3-N，既不能被微生物充分利用，還會導致大量的NH3-N通過瘤胃壁吸收進入血液。最后，被吸收NH3-N在肝臟中轉化成尿素，并以尿液的形式排出體外。NH3-N的過量吸收不但會導致氮資源的浪費，而且還會導致氨中毒[24]。因此，在奶牛飼糧中添加小肽能夠在正常范圍內降低NH3-N濃度，減少通過瘤胃壁進入血液的NH3-N，從而減輕機體對氮代謝的負擔。

飼糧中大部分的蛋白質飼料均在瘤胃中被瘤胃微生物所降解，形成肽、氨基酸及NH3-N，瘤胃微生物能夠利用NH3-N合成MCP，供給奶牛機體利用，是其最主要的氮源供應者，可滿足機體蛋白質需要量的40%～80%[25]。前人研究報道，在飼糧中添加小肽可以促進瘤胃細菌生長和纖維降解[26]，并發現無論是體內還是體外大豆小肽均可顯著提高瘤胃MCP濃度[27-28]。在本試驗中，各組瘤胃發酵液MCP濃度顯著高于對照組，與前人研究結果一致。因此，在奶牛飼糧中添加棉籽酶解蛋白能夠有效促進其瘤胃微生物對NH3-N的利用，提高瘤胃微生物合成MCP的能力，從而提高奶牛對蛋白質飼料的利用率。

VFA是碳鏈為1～6的脂肪酸，對反芻動物瘤胃的代謝有著極為關鍵的作用，其中，乙酸、丙酸和丁酸約占瘤胃發酵VFA總產量的95%[29]。有研究表明，瘤胃中VFA不僅為瘤胃消化吸收提供能量，而且還與瘤胃壁組織的發育密切相關[30]。可見，VFA對反芻動物的作用以及對反芻動物瘤胃的功能有著重要影響。前人研究表明，小肽能夠顯著提高瘤胃中VFA濃度，降低乙酸/丙酸[21,31]。而在本試驗中，TVFA和乙酸、丙酸、丁酸濃度總體呈上升趨勢，與前人研究結果一致。因此，在飼糧中添加不同濃度的棉籽酶解蛋白對瘤胃微生物體外發酵產生VFA具有一定的調控作用。

3.2 棉籽酶解蛋白對瘤胃微生物數量的影響

奶牛的瘤胃可以為多種微生物(細菌、原蟲和真菌)提供棲息地[32]，并保證微生物發酵順利進行，其發酵本質是瘤胃內微生物對飼料纖維素、蛋白質等物質進行發酵、降解，以實現更有效的利用[33]。瘤胃菌群結構與反芻動物機體健康和生產性能密切相關[34]。瘤胃的主要功能菌群包括：纖維分解菌、半纖維素分解菌、蛋白質分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌、乳酸產生菌和乳酸利用菌[35]。在本試驗中，主要研究了棉籽酶解蛋白對纖維分解菌(白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌)和蛋白分解菌(普雷沃氏菌和反芻獸新月形單胞菌)數量的影響。

瘤胃中主要的纖維分解菌包括：產琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌[36]。在本試驗中，添加棉籽酶解蛋白制劑能夠明顯增加瘤胃中黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的數量，且添加量為干物質的0.5%時，黃色瘤胃球菌數量在培養8～12 h均顯著增加，白色瘤胃球菌數量在各時段均增加，效果較為理想。目前，國內外尚無肽和纖維分解菌之間關聯的統一觀點，但是，一部分學者認為非氨態氮(蛋白質、肽和氨基酸)能夠促進瘤胃微生物的纖維降解能力[37]。王文娟等[38]也通過瘤胃灌注方法，發現大豆小肽能夠提高魯西黃牛對于纖維素的表觀消化率。李琍等[39]通過混合瘤胃微生物體外培養方法，證明肽能夠顯著提高纖維分解菌的活力和粗纖維的降解率，這與本試驗的結果相一致。

目前研究報道的蛋白降解菌主要包括嗜淀粉瘤胃桿菌、反芻獸新月形單胞菌、溶纖維丁酸弧菌和普雷沃氏菌屬，除了一些纖維降解菌沒有蛋白酶活性外，大多數的瘤胃細菌都具有一定的降解蛋白質的能力，其中反芻獸新月形單胞菌還可以利用瘤胃中的乳酸將其生成揮發性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)[40]。本試驗中選取了反芻獸新月形單胞菌和普雷沃氏菌屬中的易北普雷沃氏菌與布氏普雷沃氏菌為研究對象，試驗結果表明，在整個培養過程中，F組布氏普雷沃氏菌和反芻獸新月形單胞菌數量顯著高于其他3組，可能是添加棉籽酶解蛋白能為其生長提供底物。雖然瘤胃中反芻獸新月形單胞菌數量顯著增加，但是并未提高瘤胃中揮發性脂肪酸濃度，具體原因需進一步試驗論證。有研究指出，一定濃度的肽反而會降低某些蛋白分解菌的數量，進而會抑制蛋白質的降解[39]，而本試驗中G組布氏普雷沃氏菌數量在培養2～12 h過程中顯著低于對照組，與其說法相似。

4 結 論

① 添加棉籽酶解蛋白能夠在合理的范圍內降低瘤胃液pH和NH3-N的濃度，增加MCP濃度，促進瘤胃發酵，但對VFA的產生有一定抑制作用。

② 添加棉籽酶解蛋白能夠增加瘤胃球菌的數量，促進瘤胃微生物對纖維的降解能力。同時，棉籽酶解蛋白會減少瘤胃中普雷沃氏菌的數量，有可能會抑制瘤胃微生物對蛋白質的降解。通過瘤胃發酵參數和微生物數量綜合比較各組結果，棉籽酶解蛋白的最適添加劑量為0.5%。