發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標及腸道功能的影響

劉栩州 鞠 瑩 黃麗玲 羅陽蘭 劉明智 薄佳寧 周同宇 張宇峰 劉 闖 馮明明 閻 勇*

(1.廣西農業科學院微生物研究所，南寧530007；2.廣西農業科學院廣西作物遺傳改良生物技術重點 開放實驗室，南寧530007；3.梨樹黑土地健康食品有限公司，四平136500)

2019年，全國飼料總產量為22 885萬t，飼料工業總產值已經達到8 088億元[1]。我國飼料產業龐大，但同時我國也是一個飼料資源尤其是優質蛋白質原料匱乏的國家。每年我國糧油飼料資源進口量都在1億t以上，對進口的嚴重依賴也制約了我國飼料行業長久、健康的發展[2]。

豆粕與其他植物源性蛋白質原料相比較，具有較高的營養價值，如較高的賴氨酸和蛋白質含量，且氨基酸組成均衡，但同時豆粕也含有多種抗營養因子和致敏因子等，這些物質的存在會引起仔豬的過敏反應，很大程度上影響了營養物質的消化和吸收，嚴重時還能引起腹瀉[3]，這些因素都限制了豆粕在仔豬階段的大量添加。針對目前存在的問題，如何去除豆粕中的抗營養因子，提高其營養價值和擴大應用范圍，具有重大的現實意義。發酵無疑是去除豆粕中抗營養因子的一種經濟且有效的手段，隨著研究的深入，發酵豆粕技術日漸成熟，在亞洲和美國的養殖業中得到了大規模的應用[4]。

近些年，發酵豆粕技術在我國也得到了長足的進步和發展，但整個行業研發和產業化水平不高，生產企業普遍存在：1)菌種方面，發酵菌種來源不明、不純及退化現象嚴重；2)工藝方面，未經過嚴格的工藝匹配，往往進行粗放式自然發酵，生產工藝的不穩定致使揮發性鹽基氮、霉菌毒素及有害微生物超標嚴重[5]。這些不穩定因素嚴重制約了發酵豆粕在養殖業中的應用?；炀l酵是近年來飼料行業研究的熱點，混菌發酵不僅可降低豆粕中的抗營養因子，提高營養價值，還可保留一定量的有益菌。本試驗采用納豆芽孢桿菌和嗜酸乳酸桿菌作為發酵菌種，采用兩步法發酵制備發酵豆粕，并通過仔豬生長試驗驗證飼喂效果，旨在為飼料行業的發展提供一些借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 發酵豆粕的制備

本試驗中所用發酵豆粕是由分離自健康豬腸道的納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)和嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)進行兩步發酵后獲得。

首先是菌種擴大培養，把斜面保藏的納豆芽孢桿菌接種于LB培養基中，然后置于恒溫振蕩搖床中，在180 r/min及36 ℃條件下培養18 h；嗜酸乳酸桿菌接種于MRS培養基中，在厭氧瓶中35 ℃條件下靜置培養20 h。實驗室培養的菌種通過鏡檢達到要求后，分別接種于5 m3的不銹鋼通風發酵罐，以及5 m3的厭氧發酵罐中(通入無菌氮氣)。

接下來是固體發酵階段，豆粕經過紫外線照射滅菌后，與水和納豆芽孢桿菌菌液(1×109CFU/mL)按照體積比100.0∶80.0∶0.5的比例經過連續混料機混合均勻，再通過物料輸送設備輸送至履帶式發酵機上，通過布料板保持履帶上物料厚度為20 cm。控制發酵室的溫度為30 ℃，相對濕度為70%，并通入無菌空氣保持一定的氧氣濃度，好氧發酵階段持續時間為24 h。第1階段發酵結束后，將發酵機上的物料輸送至混料機，按照體積比100.0∶0.5比例與嗜酸乳酸桿菌菌液(1×109CFU/mL)混合均勻后輸送至下一發酵室。保持溫度和相對濕度恒定，然后緩慢通入無菌氮氣進行48 h厭氧發酵。72 h的固體發酵結束后，發酵產物通過三回程滾筒干燥機進行低溫(55 ℃)干燥，再粉碎既得成品。

1.2 試驗設計

試驗選用120頭28日齡、初始體重為(6.72±1.06) kg的健康三元雜交(杜×長×大)斷奶仔豬，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復5頭豬。試驗期為28 d，分為2個階段，第1～14天為試驗前期，第15～28天為試驗后期。

試驗飼糧組成及營養水平見表1。各組飼糧均滿足NRC(2012)推薦的營養標準，其中試驗1組、試驗2組及試驗3組分別以4.87%、9.74%和14.61%的發酵豆粕替代基礎飼糧中6%、12%和18%的豆粕，并保證蛋白質原料為各組飼糧提供相同含量的粗蛋白質。各組飼糧均添加0.3%的三氧化二鉻作為指示劑，用以測定營養物質表觀消化率。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(飼喂基礎)

每個重復的5頭豬處于同一欄中飼養，每欄配有不銹鋼食槽及自動飲水器，圈舍環境溫度控制在(28±2) ℃，相對濕度控制在(60±5)%。所有仔豬自由采食和飲水。試驗期間仔豬的消毒、免疫及驅蟲等工作按照豬場常規進行，每天早晚各打掃1遍圈舍，保持圈舍衛生清潔，并根據測定指標記錄日常數據。

1.3 樣品采集

在試驗的第14天及第28天，每欄選擇1頭與平均體重相近的仔豬，采用前腔靜脈采血方式取10 mL左右血液樣品。靜置2 h后，4 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，即得血清樣品。在試驗的第13～14天及第27～28天，收集每欄豬糞便樣品，并置于-20 ℃保存，用于測定營養物質表觀消化率。

試驗結束后，每欄選出與平均體重相近的仔豬，每組從中選擇4頭進行屠宰，分別取十二指腸、空腸和回腸樣品，用生理鹽水清洗后，浸泡在10%福爾馬林溶液中保存，用于制作組織切片。再使用載玻片分別刮取腸黏膜樣品(十二指腸、空腸和回腸)，立即置于液氮中保存，用于測定腸道炎性因子含量和消化酶活性。最后，再分別收集盲腸和結腸食糜樣品，置于-20 ℃冰箱保存，用于測定短鏈脂肪酸含量。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能及腹瀉率

在試驗第1天、第14天和第28天的08：00對仔豬進行空腹稱重，同時記錄飼料消耗量，用以計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、增重耗料比(G/F)。每日09:00和16:00，檢查每1頭仔豬肛門，觀察有無腹瀉情況并記錄，結束試驗后統計腹瀉仔豬頭數，腹瀉率計算公式如下：

腹瀉率(%)=100×仔豬腹瀉頭次總和/

(仔豬頭數×試驗天數)。

1.4.2 豆粕、發酵豆粕和飼糧中化學成分

干物質含量參照GB/T 6435—2006、粗蛋白質含量參照GB/T 6432—1994、粗脂肪含量參照GB/T 6433—2006、總能參照ISO 9831:1998、粗灰分含量參照GB/T 6438—2007、中性洗滌纖維含量參照GB/T 20806—2006、酸性洗滌纖維含量參照NY/T 1459—2007、酸溶蛋白含量參考GB/T 22492—2008、乳酸桿菌活菌數參照GB 4789.35—2016測定。

除含硫氨基酸和色氨酸外的15種氨基酸含量參照GB/T 18246—2000進行測定：樣品先在6 mol/L鹽酸、110 ℃條件下水解24 h，再使用日立L-8900型氨基酸自動分析儀進行測定。含硫氨基酸依據GB/T 15399—94進行測定：樣品置于0 ℃條件下，用甲酸氧化16 h后，再經鹽酸水解24 h，同樣使用日立L-8900型氨基酸自動分析儀進行測定。色氨酸含量依據GB/T 18246—2000中附錄A的方法進行測定：樣品在110 ℃條件下，經4 mol/L氫氧化鈉水解22 h，再用安捷倫1200型高效液相色譜進行測定。

1.4.3 腸道食糜中短鏈脂肪酸含量

短鏈脂肪酸含量根據Wu等[6]的方法測定：將冷凍的食糜置于4 ℃條件下解凍，再稱取食糜樣品0.5 g左右于10 mL離心管中，加入8 mL超純水，置于超聲儀中超聲30 min，5 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，吸取上清液，稀釋50倍后過濾，使用賽默飛ICS3000型離子色譜儀進行測定。

1.4.4 血清生化指標

血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)及免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)使用松上A6型半自動生化儀進行測定。血清谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)所列出的步驟進行測定。

1.4.5 腸黏膜中消化酶活性、炎性因子含量

腸黏膜消化酶活性根據試劑盒的說明書(南京建成生物工程研究所)，通過比色法進行測定。腸黏膜炎性因子[白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)]含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

1.4.6 腸道形態學觀察

首先把腸道樣品進行酒精脫水，再通過二甲苯進行透明處理，然后進行石蠟包埋，切成6 μm組織切片后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。在顯微鏡下，每個切片選取5個清晰完整的視野，測定絨毛高度和隱窩深度，并計算絨腺比(即絨毛高度/隱窩深度)。

1.5 統計分析

采用SAS 9.2統計軟件中的ANOVA程序對數據進行方差分析，并采用Tukey法進行多重比較，試驗結果采用“平均值±標準差”表示。以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 豆粕發酵后化學成分變化

由表2可以看出，豆粕經過發酵后，粗蛋白質和酸溶蛋白含量分別增加了12.84%和5.45倍，大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和水蘇糖含量分別降低了99.18%、91.69%和97.09%，而棉子糖和胰蛋白酶抑制劑則完全被降解；另外，賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸的含量分別提高了4.29%、16.21%和21.97%，乳酸桿菌活菌數達到1×107CFU/g。

表2 豆粕與發酵豆粕化學成分比較

2.2 發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

如表3所示，各組仔豬初始體重差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，各試驗組仔豬終末體重有所升高，且試驗2組和試驗3組顯著高于對照組(P<0.05)。在試驗前期，與對照組及試驗1組相比，試驗2組和試驗3組的ADG顯著提高(P<0.05)，腹瀉率顯著降低(P<0.05)，同時試驗3組的G/F也顯著提高(P<0.05)。在試驗后期，各組ADG、ADFI、G/F及腹瀉率差異都不顯著(P>0.05)。從全期來看，與對照組和試驗1組相比，試驗2組和試驗3組的ADG顯著提高(P<0.05)，腹瀉率顯著降低(P<0.05)，同時試驗3組的G/F也顯著提高(P<0.05)。

表3 發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

2.3 發酵豆粕對斷奶仔豬營養物質表觀消化率的影響

如表4所示，在試驗第14天，與對照組相比，各試驗組干物質、總能、粗蛋白質和有機物的表觀消化率均顯著提高(P<0.05)。在試驗第28天，試驗3組總能和有機物的表觀消化率顯著高于對照組和試驗1組(P<0.05)，與試驗2組差異不顯著(P>0.05)。

表4 發酵豆粕對斷奶仔豬營養物質表觀消化率的影響

2.4 發酵豆粕對斷奶仔豬血清生化指標的影響

如表5所示，在試驗第14天，與對照組相比，試驗2組和試驗3組血清中IgA含量和SOD活性顯著提高(P<0.05)。另外，與對照組相比，各試驗組血清中IgM含量均顯著提高(P<0.05)，且試驗3組血清中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)。在試驗第28天，與對照組相比，各試驗組血清中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，同時試驗2組和試驗3組血清中T-AOC顯著提高(P<0.05)。

表5 發酵豆粕對斷奶仔豬血清生化指標的影響

2.5 發酵豆粕對斷奶仔豬腸道食糜中短鏈脂肪酸含量的影響

如表6所示，與對照組相比，試驗2組和試驗3組盲腸食糜中丁酸含量顯著提高(P<0.05)。

表6 發酵豆粕對斷奶仔豬腸道食糜中短鏈脂肪酸含量的影響

2.6 發酵豆粕對斷奶仔豬腸黏膜中消化酶活性的影響

如表7所示，與對照組相比，各試驗組十二指腸和空腸黏膜中胰蛋白酶活性均顯著提高(P<0.05)，同時試驗3組十二指腸黏膜以及試驗2組和試驗3組空腸黏膜中蛋白酶活性也顯著提高(P<0.05)。

表7 發酵豆粕對斷奶仔豬腸黏膜中消化酶活性的影響

2.7 發酵豆粕對斷奶仔豬腸道形態的影響

如表8所示，與對照組相比，各試驗組十二指腸絨毛高度和絨腺比以及空腸絨毛高度均顯著提高(P<0.05)，且試驗1組和試驗2組十二指腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)。

表8 發酵豆粕對斷奶仔豬腸道形態的影響

2.8 發酵豆粕對斷奶仔豬腸黏膜中炎性因子含量的影響

如表9所示，與對照組相比，各試驗組空腸黏膜中TNF-α含量顯著提高(P<0.05)。

表9 發酵豆粕對斷奶仔豬腸黏膜中炎性因子含量的影響

3 討 論

Chi等[3]研究發現，豆粕經過芽孢桿菌和乳酸桿菌發酵后，抗營養因子和抗原蛋白大部分被降解，豆粕的營養價值得到了提升。而Yuan等[7]也發現，豆粕經過發酵后大豆肽的含量提高了6倍，本試驗結果與以上研究結果相一致。本試驗所用發酵豆粕為采用兩步發酵法制備，該工藝可充分考慮了好氧菌(納豆芽孢桿菌)和厭氧菌(嗜酸乳酸桿菌)不同的環境條件，先由芽孢桿菌對豆粕進行好氧發酵，再與乳酸桿菌混合均勻后，在無氧條件下進行厭氧發酵；并且，對整個發酵過程的溫度、濕度及通風等條件進行控制，通過兩步發酵最大程度滿足不同益生菌對不同生長環境的需要。經兩步法發酵后，豆粕中抗營養因子含量降低，營養物質含量升高。這主要原因是由于芽孢桿菌、乳酸桿菌能夠分泌豐富的酶類物質，如蛋白酶等，這些酶能夠把一些諸如抗原蛋白等大分子蛋白質降解，轉化為易于吸收的肽類等物質[8]。另外，豆粕經過發酵后還含有一定量的乳酸桿菌活菌，而目前乳酸桿菌已經成為飼料中應用最廣的益生菌制劑，大量的研究報道其可以提高豬的生長性能、飼料轉化率、營養物質消化率，并可以調節免疫及改善腸道健康等[9]。

本試驗結果表明，發酵豆粕可以顯著提高仔豬的生長性能，同時降低腹瀉率。這和先前的一些研究結果相一致，如Kim等[10]和Zhang等[11]發現發酵豆粕可以顯著提高豬的ADG和G/F。發酵豆粕對生長性能的提高很大程度上是由于發酵去除了豆粕中的抗營養因子，提升了豆粕的營養價值；另外，益生菌也會對提高生長性能起到一定作用，如Pollmann等[12]研究發現，在斷奶仔豬飼糧中添加乳酸桿菌能夠提高其ADG和G/F，而乳酸桿菌能夠提高生長性能，主要在于乳酸桿菌改善了豬的腸道福利[9]。

Song等[13]研究發現，發酵豆粕能夠顯著降低仔豬腹瀉率，本試驗結果也得出同樣的結論。發酵豆粕降低仔豬腹瀉率的原因很大程度上是因為豆粕通過發酵后極大地降解了如大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白等抗原蛋白；另外，發酵豆粕中的益生菌能夠在一定程度上抑制致病菌的增殖[14]，從而達到了降低腹瀉率的作用。

本試驗中對照組的營養物質表觀消化率最低，其原因在于豆粕中抗營養因子、胰蛋白酶抑制劑以及一些難以消化的蛋白質、糖類等的存在[15]。Teng等[16]認為，發酵可以除去豆粕中的胰蛋白酶抑制劑，而這能夠提高蛋白質的消化率。同時，乳酸桿菌、小肽和酶等物質對提高營養物質消化率也可能起到了一定的促進作用[7]。Zhao等[17]認為，乳酸桿菌作為益生菌可以提高諸如β-半乳糖苷酶的活性，這會促進胃腸道蠕動，從而提高營養物質的消化率。

抗氧化酶活性在一定程度上能夠反映仔豬的氧化應激程度。在本試驗中，飼糧中添加發酵豆粕增加了斷奶仔豬血清中SOD和GSH-Px的活性，這也說明發酵豆粕可以在一定程度上緩解仔豬的氧化應激。而T-AOC反映的是非酶抗氧化系統，發酵豆粕對于斷奶仔豬血清中T-AOC的提高，說明發酵豆粕也可以在一定程度上防止內源性脂質的氧化和過氧化。

發酵豆粕能夠提高斷奶仔豬血清中IgA和IgM含量，說明發酵豆粕可以促進仔豬的免疫系統發育，增強免疫功能。豆粕中含有大量的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，二者的存在會損壞仔豬的免疫系統，而發酵對這些抗營養因子的降解是仔豬免疫功能改善的最大原因[18]。

短鏈脂肪酸是豬后腸道中微生物的發酵產物，短鏈脂肪酸大約能夠提供機體所需維持能量的10%。本試驗中，發酵豆粕提高了斷奶仔豬盲腸食糜中丁酸含量，這一結果和Xie等[19]的研究結果是一致的。Meimandipour等[20]認為，乳酸桿菌分泌的乳酸能夠促進腸道中產生丁酸的細菌的增殖，從而提高食糜中丁酸的含量。

胰蛋白酶抑制劑能夠抑制胰蛋白酶的活性，本試驗中豆粕通過發酵后，胰蛋白酶抑制劑被完全降解，結果顯示斷奶仔豬十二指腸和空腸黏膜中胰蛋白酶活性提高，這符合試驗預期。

腸道絨毛高度、隱窩深度和絨腺比是重要的形態學指標，可以一定程度上反映腸道的屏障功能和吸收功能[18]。而豆粕中的抗原蛋白會通過損壞腸道正常形態影響機體對營養物質的消化和吸收[21]。本研究發現，發酵豆粕可以改善斷奶仔豬十二指腸和空腸的形態，說明發酵豆粕能夠在一定程度上促進營養物質的吸收。

促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN-γ)在介導炎癥反應中至關重要，而斷奶應激會促進仔豬腸道內炎性因子的表達[22]。本試驗中發酵豆粕減少了空腸黏膜中TNF-α的含量，說明發酵豆粕能夠在一定程度上調節斷奶仔豬腸道黏膜的炎癥反應。

發酵豆粕與未發酵豆粕相比，除營養成分含量存在差異外，一些性狀及功能性物質含量也會有變化。如Amadou等[23]研究發現，使用植物乳桿菌發酵大豆蛋白粉，其功能性狀發生了很大變化，如體外蛋白質消化率、可溶性氮含量及乳化活性等。并且，大豆蛋白粉在微生物發酵和蛋白酶酶解共同作用下，顯示出了更高的變性溫度(103.77 ℃)，而未經處理的大豆蛋白粉變性溫度為61.67℃。另外，Moktan等[24]對Kinema(一種類似豆豉的大豆發酵食物)進行的研究顯示，與未發酵大豆相比，其總酚含量提高了1.44倍，抗氧化活性也有顯著提高。目前，關于發酵豆粕功能性物質含量及性狀變化還缺少相關資料，期待未來更進一步深入研究。

4 結 論

① 豆粕經納豆芽孢桿菌和嗜酸乳酸桿菌兩步發酵后營養品質得到提升。

② 在本試驗條件下，斷奶仔豬飼糧中添加本試驗所制備的兩步法發酵豆粕可提高28～56日齡斷奶仔豬的生長性能、營養物質表觀消化率并降低腹瀉率，同時還可提高腸黏膜消化酶活性，改善腸道形態，其中添加9.74%和14.61%的發酵豆粕在改善仔豬生長性能等方面的效果要優于添加4.87%的發酵豆粕。綜合考慮成本因素，推薦仔豬飼糧中以9.74%的發酵豆粕替代12%的豆粕使用。