黃芩素結構與生物學功能關系研究進展

余詩強 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京102206； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

黃芩素(baicalein，BAI)也稱為黃芩黃素、黃芩苷元，主要來源于唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalensis)，是一種以黃酮類化合物為主效因子的植物提取物，具有抗菌、抗炎、抗氧化應激等作用[1-3]。BAI在黃芩中含量豐富，一般黃芩藥材中BAI的含量在0.1%～1.5%，優質黃芩中BAI的含量可達到3.89%[4]。隨著我國飼料端禁用抗生素以及對綠色健康養殖技術研究的不斷深入，對天然植物中生物活性物質的研究和應用成為健康營養技術策略的核心環節[5]。近年來，現代分子生物學技術和分析技術的發展促進了天然植物中生物活性物質作用途徑與機制的研究[6]。本文通過解析BAI結構與生物學功能的關系，深入分析BAI的抗菌與免疫調節相關途徑與機制，以期為BAI在動物生產中的研究與應用提供理論依據。

1 BAI的理化性質與代謝

BAI是從黃芩的干燥根中提取出的主要有效成分，化學名稱為5，6，7-三羥基黃酮，其性狀為黃色針狀結晶，分子式為C15H10O5，相對分子質量為270.24，易溶于丙酮、醇溶液、醋酸乙酯等，微溶于氯仿[7]，結構式如圖1所示。常見BAI提取方法包括酸水解法、浸漬法、超聲波提取法和酶解法等[8]。研究表明，利用酶解法，以水為提取溶劑，借助于提取原料中不同物質的粒度和溶解度之差，提取總物質中BAI含量可達到63%以上[9]。張濤等[10]探究發現，在料液比1∶22、酶料比2∶1的條件下，酶提6 h、50 ℃超聲處理20 min，BAI的提取率可達到23.122 mg/g。

圖1 黃芩素的結構式

BAI呈弱酸性，進入體內后非離子狀態不會被破壞，同時對胃黏膜具有良好的親和力，大部分可以被其吸收[11]。BAI主要經肝臟代謝，少部分經腸道代謝[12]。在體外肝勻漿孵育液中進行的代謝試驗證明，BAI的代謝途徑為脫水、羥基化、脫羥基化、糖基化、葡萄糖醛酸化和甲基化[13]，其產生的已知8種代謝產物見圖2[14]。由于BAI分子具有較大的疏水性，故其以被動擴散的方式進入小腸壁上皮細胞[15]。進入腸道后，由腸壁上皮細胞中存在的甲基化酶、葡萄糖醛化酶和硫酸化酶等多種代謝酶作用下進行代謝，同時BAI進入小腸壁上皮細胞后，可經尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)作用轉化為黃芩苷，黃芩苷經多藥耐藥相關蛋白3(MRP3)轉運進入血液，經腸系膜靜脈進入肝臟被進一步代謝，其代謝物經血液運輸全身[16]。GO功能富集分析結果顯示，BAI在體內的作用靶點主要分布在細胞質、細胞器膜、內質網膜等部位，其與金屬離子、陽離子結合可以發揮催化氧化還原酶活性功能，同時參與細胞脂質、羧酸、有機酸代謝和脂肪酸合成等過程[17]。研究顯示BAI進入動物體內后有35%轉化為黃芩苷，BAI與黃芩苷具有協同作用，兩者可以在體內共同發揮抗炎、抗氧化等生物學功能，由于BAI在體內親脂性高，故其在體內廣泛分布并發揮作用[18]。

2 BAI結構與生物學功能的關系

2.1 抗菌作用

細菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)在多種內源性和藥物性葡萄糖醛酸苷的解偶聯中起關鍵作用，進而調控細菌的生長[19]，BAI結構中的羥基可與EcGUS活性位點結合形成氫鍵發揮抑菌作用，同時分子中的羥基可抑制內皮細胞生長因子產生，達到抑制細菌生長的目的[20]。研究證明，BAI可通過提高細菌細胞膜的通透性、破壞細胞壁完整性、降低菌體酶活性、抑制細菌體內能量生成和核苷酸合成，達到降低金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念球菌(Candidaalbicans)等細菌的致病能力[21-23]。Chen等[24]研究發現，BAI可以阻止細菌生物膜的形成并破壞生物膜，減少葡萄球菌腸毒素A和α-溶血素的產生，達到抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖，并抑制群體感應系統。BAI是控制食源性病原體的潛在抗菌劑，其可以抑制腸出血性大腸桿菌產生志賀毒素Stx1和Stx2，減少細胞毒性，保護機體健康[1]。同樣，80 mg/L BAI可以顯著抑制大腸桿菌生物膜的形成，通過在大腸桿菌生物膜合成前干擾多糖細胞間黏附素(PIA)的合成起到抑菌作用[25]。

BAI對引起動物乳房炎的病原菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑制作用[26]，特別是金黃色葡萄球菌，其可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜的生成，阻礙其生長繁殖，同時可以抑制菌株合成PIA，減少其胞外DNA(eDNA)的釋放，0.04 mg/mL BAI作用于金黃色葡萄球菌時eDNA的釋放量減少97%，相關基因icaA表達量減少62%，cidA表達量減少41%，顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，達到抑菌目的[27]。薛芳翰等[28]探究了BAI對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的抑制作用，結果表明，BAI能夠極顯著抑制細菌的生長，且對細菌的最小抑制濃度(MIC)為0.04 mmol/L，當濃度達到0.08 mmol/L時具有殺菌效果。采用指紋圖譜結合灰度分析對黃芩中活性成分對白色念球菌的抑制效果作進一步分析，發現黃芩中有17種活性成分對白色念球菌具有抑制作用，其中BAI抑制活性更明顯，關聯度達0.798 6，是發揮作用的標志物[29]。16 μg/mL的BAI與環丙沙星協同作用時，可降低BAI和環丙沙星的MIC并提高對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用[30]。同時，BAI可以平衡腸道菌群結構，給小鼠前腹腔注射100 mg/kg的BAI可以治療電離輻射引起的腸道菌群失衡疾病[31]。另外，張濤等[10]研究發現，加入10 mg/mL的BAI溶液時，金黃色葡萄球菌的生長被抑制，加入濃度超過20 mg/mL的BAI溶液時，大腸桿菌的生長被抑制。此外，黃芩素對金黃色葡萄球菌感染引起的皮膚炎癥小鼠具有顯著的治療作用，血液可通過吸收黃芩素，增強巨噬細胞的宿主防御功能，通過免疫調節來提高細菌清除率，從而減輕金黃色葡萄球菌引起的炎癥，其作用效果與抗生素有類似之處[32]。

2.2 抗炎作用

BAI可以抑制炎性介質的釋放并調節信號通路，從而達到抗炎作用，其可以與核因子-κB(NF-κB)抑制蛋白激酶(IKK)的亞基IKKβ(NF-κB信號通路經中的上游靶點之一)相結合抑制NF-κB信號通路[33]。研究證明，濃度為100 μmol/L的黃芩素能顯著抑制脂多糖(LPS)誘導巨噬細胞(RAW 264.7)釋放炎癥介質[前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)]，發揮抗炎作用[34-35]。Duan等[36]證明100～200 mg/kg的BAI能顯著抑制血清中NO、IL-6、白細胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的釋放，從而抑制炎癥發生。同時，BAI在S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的存在下，經兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)轉化為中間代謝產物木蝴蝶素A(oroxylin A)，木蝴蝶素A有顯著的抗炎作用[半抑制濃度(IC50)=28 μmol/L][37]。Zhou等[38]證明木蝴蝶素A可以抑制體內IL-1β、IL-6、TNF-α的產生及NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體的活化，從而達到抗炎的目的。由于黃芩素在體內可以轉化為黃芩苷，黃芩苷結構中Δ2平面的雙鍵結構在抗炎反應中發揮著重要作用，其可以作用于環氧化酶起到抗炎效果，同時其結構中的自由酚羥基和羰基也具有一定的抗炎作用[39]。研究證明，黃芩苷可以通過抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、白細胞介素-17(IL-17)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9) 的產生和調節NF-κB信號通路等方式發揮抗炎作用[40]。

M1(BGG)：黃芩素6,7-二-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein6,7-di-O-glucuronide；M2(BGGlu)：6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein6-O-glucoside-7-O-glucuronide；M3(7BG)：黃芩素7-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein7-O-glucuronide；M4(6BG)：黃芩素6-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein6-O-glucuronide；M5(7BS)：黃芩素7-O-硫酸酯苷 6-O-glucoside-baicalein-7-O-sulfate；M6(6BS)：黃芩素6-O-硫酸酯苷 7-O-glucoside-baicalein-6-O-sulfate；M7(6-MEBG)：黃芩素6-OCH3-7-O葡萄糖醛酸 6-methoxybaicalein7-O-glucuronide；M8(7-MEBG)：黃芩素7-OCH3-6-O葡萄糖醛酸7-methoxybaicalein6-O-glucuronide。

研究發現，以2 mL/kg的劑量給大鼠靜脈注射濃度為10 g/L的BAI時，結果顯示BAI能減弱重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠的炎癥反應，其作用機制與調控細胞炎癥的p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路有關，通過上調抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和下調促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達達到抑制細胞炎癥的目的[41]。此外，BAI也可以作用于不同的酶達到抗炎目的，其中環氧化酶是重要的炎性介質，0.5%的BAI可以作用于環氧化酶并抑制炎癥信號通路中樞的NF-κB途徑，減少炎癥因子的產生和釋放，表現出顯著的抗炎效果[42]；通過大鼠體內試驗發現，150 mg/kg的BAI可抑制白細胞介素-8(IL-8)的釋放及環氧化酶-2的合成，同時增加熱休克蛋白70的產生，提高機體的抗炎能力，進而阻斷炎性因子引發炎癥損傷[43]。BAI也可以減緩細胞凋亡，恢復線粒體活力，抑制細胞炎癥，促進機體健康[44]。在研究LPS誘導小鼠乳房炎的模型中發現，BAI能明顯減輕LPS對乳腺的損傷，抑制髓過氧化物酶(MPO)活性和TNF-α、IL-1β水平，同時阻斷Toll樣受體4(TLR4)的表達，抑制NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的磷酸化，以及阻止MAPK信號通路中p38、細胞外信號調節激酶(ERK)和c-Jun NH2末端激酶(JNK)的磷酸化，最終達到治療乳房炎的目的[45]。

2.3 抗氧化應激作用

BAI分子結構中含有3個羥基，其在體內能夠通過脫羧的方式清除自由基，達到調節氧化應激的作用，其對烷過氧自由基、超氧陰離子以及1,1-二苯基-2-苦肼基等自由基有很強的清除作用[46]。在清除自由基的過程中，BAI存在的3個相鄰的羥基可形成半醌式結構達到抗氧化的作用，過程如圖3所示[47]。其存在的羥基可以通過氧化還原依賴機制減輕線粒體的損傷，在保護線粒體氧化應激的過程中起關鍵作用[48]。BAI結構中的C2-C3雙鍵具有提供電子的能力，同樣發揮抗氧化作用[49]。另外，部分BAI在體內轉化成黃芩苷，黃芩苷結構中的6-酚羥基易斷裂發生抽氫反應，進而發揮抗氧化作用[50]。研究表明，黃芩苷可以逆轉應激引起的細胞損傷，其通過下調丙二醛(MDA)和4-羥基醛(4-HNE)水平，抑制內源性活性氧(ROS)的產生，提高線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)mRNA和蛋白表達水平及ALDH2活性，發揮顯著的抗氧化作用[51]。

圖3 黃芩素清除自由基的過程

Ha等[52]研究發現，100 mmol/L的BAI可以顯著降低內質網應激的2個關鍵途徑基因免疫球蛋白結合蛋白(BiP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達水平，同時降低ROS水平，證明BAI具有減輕細胞氧化應激的作用。研究發現98%的BAI可以有效抑制過氧化氫(H2O2)誘導的細胞氧化應激和ROS的生成，同時通過調節核因子-E2相關因子2(Nrf2)信號通路保護C6神經膠質細胞免受H2O2誘導的氧化應激和凋亡[53]。采用不同溶劑制備BAI，發現BAI在大鼠肺線粒體中表現出顯著的抑制H2O2誘導脂質過氧化(LPO)的作用，有效地保護細胞損傷，減少大鼠肺線粒體的氧化應激[54]。另外，在家禽飼糧中添加100～200 mg/kg的BAI可顯著提高肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性，從而提高抗氧化能力[55]。在豬冷凍稀釋精液中單獨添加0.04或0.06 g/L的BAI，可以提高解凍后精子中GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶的活性，同時降低MDA水平，提高精子抗氧化能力和成活率[56]。此外，BAI可以呈劑量依賴的方式降低MDA水平，抑制炎性因子產生，調節蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑，保護肝臟免受氧化應激的損傷[57]。綜上所述，BAI可以通過清除自由基、降低ROS水平、調節信號通路和代謝途徑來減少氧化應激的發生，其自身化學結構是發揮抗氧化應激作用的主要原因。

2.4 其他作用

大量試驗證明BAI具有抗腫瘤、抗過敏、降血糖和保護免疫器官的作用。BAI通過調節不同的代謝信號通路抑制腫瘤細胞的發展，同時降低腫瘤生長和轉移速度，顯著降低腫瘤組織中CD31(內皮細胞標記物)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，壁細胞標記物)的表達，誘導腫瘤細胞死亡，是治療腫瘤疾病的優選藥物[58]。BAI的毒副作用較化療藥物小，其具有調節細胞周期和清除氧化自由基的能力，同時減弱MAPK、AKT或mTOR的活性，通過激活半胱天冬酶-9(Caspase-9)/半胱天冬酶-3(Caspase-3)誘導細胞凋亡以及減少基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)/MMP-9的表達，抑制腫瘤侵襲和轉移的能力，在臨床上其廣泛用于治療口腔癌、乳腺癌、膀胱癌等疾病[59-61]。BAI也具有降低血糖的作用，250 mg/kg的BAI可以降低血糖和MDA水平，抑制活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)表達，促進胰島細胞分泌胰島素(INS)，提高INS水平和SOD活性，從而顯著降低大鼠血糖水平，其作用機制與BAI抑制胰島細胞的凋亡有關[62]。另有研究證明，BAI在抗過敏方面也有顯著的治療效果，但具體作用機制尚不明確[63]。

3 小 結

現代生物和分析技術的發展促進了對BAI的結構及其與抗菌、抗炎、抗氧化等生物學功能關系的研究。據農業農村部第194號公告，自2020年7月1日我國在飼料端全面禁止添加抗生素，植物提取物作為生物活性物質被認為是后抗生素時代解決健康養殖的核心策略[64]。BAI作為植物提取物中的優質黃酮類化合物，其對動物氧化應激-炎癥反應-免疫三方聯動效應的穩定具有促進作用，對動物疾病的預防、治療具有一定潛力[65]。但目前BAI及其代謝產物在動物體內發揮作用的途徑、機理以及不同動物上的適宜使用劑量有待進一步研究。