內質網應激信號影響豬腸道屏障功能的研究進展

靳宇航 賈 海 王仁杰 武振龍

(中國農業大學動物科學技術學院，北京100193)

腸道是動物機體與外界環境直接接觸且表面積最大的器官，具有消化、吸收、代謝與免疫等多種生物學功能[1]。腸道上皮屏障具有獨特的選擇透過性，能夠保障機體對飼糧中養分的吸收，并有效地抑制腸腔中病原微生物及有毒有害物質透過屏障進入機體內環境，從而維持動物機體正常的生理機能[2]。

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是細胞內由單層膜折疊構成的網狀結構細胞器，能夠對分泌性蛋白和膜蛋白進行折疊、加工和修飾，同時內質網也參與了機體脂質代謝、能量代謝和細胞內鈣離子(Ca2+)穩態的調節[3]。蛋白質在內質網中的折疊、修飾和加工的過程依賴于內質網功能穩態。能量缺乏、氧化應激、Ca2+失衡、代謝異常、蛋白質的糖基化修飾異常和炎癥都會引發內質網功能紊亂，未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在內質網中蓄積，引發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。有研究表明，斷奶應激誘導仔豬腸道中內質網應激相關蛋白表達水平顯著升高，提示仔豬腸道功能障礙可能與上皮細胞中內質網應激有關，但具體機制尚不明確[5-6]。本文對內質網應激信號影響豬腸道屏障功能的研究進展進行綜述，以期為通過內質網應激信號通路改善豬腸道健康提供理論參考。

1 豬腸道上皮細胞結構與功能

腸道是動物機體對營養物質消化吸收的重要器官，也是內外環境之間進行物質交換的媒介。腸道上皮由單層細胞排列而成，是機體內環境與腸腔內容物之間的屏障。腸道上皮通過小腸絨毛及細胞微絨毛的立體結構使腸腔具有更大的單位接觸面積，加快了營養物質的消化吸收[7]。仔豬階段的腸道健康不僅影響仔豬生長性能和成活率，還會間接影響其生長育肥階段的生長性能。現代規模化豬場為提高母豬年產仔數將仔豬斷奶時間提前至21日齡甚至更早。此時受環境變化、飼糧改變、生理以及心理等多方面的影響，早期斷奶使仔豬腸絨毛萎縮和消化酶活性降低[8]，采食量下降，腸上皮細胞凋亡水平顯著升高[9]，仔豬腸道和免疫系統出現功能障礙，引發生長發育遲緩等健康問題[10]。

小腸隱窩中的干細胞不斷增殖并最終分化為成熟的上皮細胞并向絨毛頂端遷移，補充絨毛頂端因凋亡而脫落的細胞，這種腸道上皮細胞的動態更新機制保障了小腸結構的完整性[11]。成熟的腸道上皮細胞根據功能類型可分為潘氏細胞(Paneth cells)、杯狀細胞(goblet cells)、腸內分泌細胞(enteroendocrine cells，EC)和微皺褶細胞(microfold cells，M cells)。潘氏細胞位于隱窩底部，呈椎體形，可分泌大量抗菌活性物質，如溶菌酶和α-防御素，以防止腸腔中有害微生物的侵襲[12]。杯狀細胞可分泌黏液、三葉肽因子(trefoil peptides)和抵抗素樣分子β(resistin-like molecules β，RELMβ)，保護腸上皮屏障。腸內分泌細胞可通過分泌激素肽參與上皮細胞修復和血管生成等生理過程[13]。微皺褶細胞負責將腸腔內細菌和抗原信號向下層免疫細胞傳遞，是機體識別抗原過程中的重要媒介[14]。

腸道上皮通過跨細胞途徑和細胞旁路途徑實現營養物質轉運并阻止腸腔中有毒有害物質進入機體內環境。跨細胞途徑是營養物質消化吸收的主要途徑，上皮細胞膜表面的轉運載體和離子通道允許腸腔內的水、電解質和小分子營養物質透過屏障進入體內。相鄰上皮細胞之間通過緊密連接(tight junctions，TJs)、黏附連接(adherens junctions，AJs)和細胞橋粒等蛋白復合物實現細胞旁路途徑的選擇透過性，抵御病原、微生物和毒素的入侵[15]。緊密連接蛋白間相互作用形成“吻斑”(kissing points)，封閉相鄰細胞間的間隙，當緊密連接蛋白表達和分布出現異常時，腸道上皮屏障通透性增加，因此緊密連接蛋白是維持上皮屏障功能的關鍵限制性因素。

2 未折疊蛋白反應與內質網應激

細胞內外環境中多種應激因素(如饑餓、缺氧、感染、代謝紊亂)可導致內質網的蛋白折疊功能紊亂，機體為恢復細胞穩態和內質網的正常功能，啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，降低蛋白質合成速率，降解異常折疊蛋白，減少錯誤折疊蛋白累積對細胞生理功能的影響[16-17]。

哺乳動物內質網膜上的肌醇酶1(inositol-requiring kinase 1，IRE1)、蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)和轉錄活化因子6(activating transcription factor 6，ATF6)是感受內質網應激的重要感應蛋白[18]。在非應激狀態下，葡萄糖調節蛋白(GRP78/BiP)作為內質網腔中的分子伴侶能夠與3種內質網應激感受蛋白相互結合，阻斷其下游信號的通路。當內質網處于應激狀態時，GRP78/BiP與異常折疊蛋白結合，從而釋放3種內質網應激感受蛋白，進而激活下游信號，恢復內質網功能穩態[19]。

2.1 IRE1信號通路

在3種應激感受蛋白中，IRE1是最為保守的內質網應激感受分子。已發現的哺乳動物IRE1有2種，分別為IRE1α和IRE1β，前者在不同組織及細胞中廣泛表達，而后者主要位于腸道和呼吸道上皮細胞[20]。細胞受到外來刺激而誘發內質網應激時，IRE1與GRP78/BiP蛋白分離后被磷酸化激活，利用其核酸內切酶活性從X盒結合蛋白1(X-box-binding protein 1，XBP1)的mRNA中特異性剪切26 bp的內含子片段，從而改變XBP1 mRNA的開放閱讀框，生成具有功能活性的XBP1剪接異構體(XBP1s)[21]。XBP1s與對應的UPR反應元件結合，在不同細胞或條件下分別調控分泌、脂質代謝、葡萄糖穩態和炎癥反應等功能相關基因的轉錄與翻譯[22]。近期有研究表明，IRE1α可誘導XBP1以外的mRNA降解，通過IRE1依賴性降解調控途徑(regulated IRE1-dependent decay，RIDD)減少蛋白質的生成，從而緩解內質網應激狀態[23-24]。此外，被激活的IRE1α與TNFα受體相關因子2(TNFα receptor-associated factor 2，TRAF2)結合，進而激活核因子-κB(NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)，促進下游細胞炎癥因子和凋亡信號轉導[20]。

2.2 PERK信號通路

PERK是一種具有絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域的Ⅰ型跨膜蛋白，在內質網應激過程中起到重要的信號轉導作用。當內質網應激發生時，GRP78/BiP釋放出來的PERK形成二聚體，并通過自磷酸化作用而被激活[25]。活化的PERK使真核翻譯起始因子2的α亞基(eukaryote initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，抑制蛋白質合成從而降低內質網中錯誤折疊蛋白的負荷[26]。進一步研究發現，eIF2α磷酸化激活后可選擇性促進活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的翻譯，進而調控氧化應激和內質網應激介導的細胞凋亡[27]。CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)是內質網應激信號中重要的轉錄因子，可以被ATF4或其他因子激活，從而介導內質網應激相關的凋亡信號[28]。

2.3 ATF6信號通路

ATF6是一種具有羧基端應力感受結構域和氨基端bZip轉錄因子結構域的跨膜蛋白[29]。目前，在哺乳動物中已發現2種ATF6同源蛋白，即ATF6α和ATF6β。ATF6α具有UPR相關基因激活特性[30]。當內質網腔中未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白蓄積時，ATF6α與GRP78/BiP分離，并從內質網轉移至高爾基體，隨后其跨膜結構域和高爾基體腔內結構域被高爾基酶位點1蛋白酶(S1P)和高爾基酶位點2蛋白酶(S2P)水解，釋放出的ATF6片段(ATF6f)進入細胞核并與內質網應激反應元件(endoplasmic reticulum-stressed response elements，ERSE)結合，上調參與蛋白折疊的靶基因或內質網相關蛋白降解(ER-associated protein degradation，ERAD)信號通路的轉錄水平，通過促進蛋白折疊或降解錯誤折疊蛋白的方式應對內質網應激[31-33]。

由上可知，內質網應激是細胞內質網功能穩態被打破的狀態，細胞通過IRE1、PERK和ATF6 3條途徑激活UPR以減輕錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白在內質網中的負荷，這種適應性修復機制有利于重建細胞穩態，保證細胞存活。但當細胞無法通過UPR進行自我修復而長期處于內質網應激時，細胞凋亡途徑被激活，主動清除損傷細胞恢復機體穩態。

3 內質網應激與豬腸道屏障

腸道上皮細胞、微生物與營養素通過復雜的互作機制，維持腸屏障功能。腸上皮細胞能夠感受環境中的各種信號，并通過適應性機制調節其代謝和生理功能。已有研究表明，內質網應激信號通路與炎癥性腸病、腸易激綜合癥等腸道疾病密切相關[34-36]。

3.1 斷奶應激與內質網應激

早期斷奶的小鼠結腸隱窩深度降低，杯狀細胞數量減少，內質網應激相關蛋白，如CHOP、BiP、活化型半胱天冬酶-3(cleaved-caspase-3)等蛋白表達水平升高，這些變化在添加內質網應激相關蛋白的抑制劑后得到明顯改善，提示內質網應激與腸道屏障之間可能存在相關性[37-38]。豬由于其消化吸收、物質代謝、腸道微生物組成等與人具有較高的相似性，是多種人類疾病研究的重要動物模型。本團隊最近的研究發現，斷奶引起仔豬空腸、回腸組織中ATF6α、p-IRE1α和p-eIF2α，以及下游凋亡相關蛋白JNK和CHOP蛋白表達水平顯著升高，炎性細胞因子白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-8蛋白表達水平明顯高于同日齡哺乳仔豬。7～21日齡的哺乳仔豬補充谷氨酰胺(每天1.52 g/kg BW)可有效緩解斷奶應激引起的空腸內質網應激相關蛋白(BiP、ATF6α、p-IRE1α和p-eIF2α)和凋亡相關蛋白[CHOP、p-JNK、半胱天冬酶-12(caspase-12)、cleaved-caspase-3和B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)]的表達上調，降低炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)蛋白的表達[6]。另一項研究發現，7～21日齡的哺乳仔豬額外補充相當于從母乳中攝取的甘氨酸1～2倍的量，能有效緩解斷奶應激引發的腸道損傷，降低血清中二胺氧化酶活性，降低斷奶應激誘導升高的GRP78/BiP、p-IRE1α、CHOP和p53蛋白的表達水平，提高空腸絨毛高度與隱窩深度比值，增加杯狀細胞數量，并上調咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白-1(claudin-1)和胞質緊密連接蛋白-1(ZO-1)等緊密連接蛋白表達量[39]。

衣霉素(tunicamycin)是一種由細菌代謝產生的天然抗生素，可通過抑制內質網中新合成蛋白N端糖基化，從而引發內質網應激，因此常用于構建內質網應激的細胞或動物模型[40-42]。Huang等[43]研究發現，枸杞多糖(10 μg/mL)可明顯緩解衣霉素誘導p-PERK、p-eIF2α、ATF6、IRE1和CHOP的蛋白表達水平的升高，并抑制細胞凋亡。Li等[44]研究發現，添加β-胡蘿卜素(80 mg/kg BW)可緩解早期斷奶引起IRE1α和PERK的磷酸化水平，抑制由內質網應激誘導的豬腸上皮細胞凋亡，從而改善豬的腸道健康和生長性能。最近的研究發現，大蒜素可調節豬空腸肌醇酶1/x盒結合蛋白-1s(IRE1/XBP-1s)信號通路，降低eIF2α和ATF4的磷酸化水平，提高緊密連接蛋白的表達，改善早期斷奶仔豬腸上皮細胞結構和功能[45]。Jiang等[46]通過體外研究發現，谷氨酰胺(3.0 mmol/L)也可通過IRE-1/XBP-1s信號通路緩解衣霉素誘導的豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)內質網應激。這些研究提示，斷奶應激通過激活內質網應激信號通路引起上皮細胞凋亡，進而破壞腸道屏障，通過小分子抑制劑或營養物質抑制內質網應激信號可能是潛在的保護腸道屏障的方法。

3.2 細菌感染與內質網應激

腸道中大腸桿菌和沙門氏菌感染是引起豬腹瀉及腸炎的常見細菌性疾病。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性菌外膜表面的重要蛋白，能夠被Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)識別并誘發腸道炎癥反應，引起仔豬腹瀉[47]。研究發現，大腸桿菌(109CFU/kg)感染可導致斷奶仔豬空腸和回腸組織中內質網應激信號通路相關蛋白(GRP78/BiP和CHOP)表達水平升高，并上調半胱天冬酶-11(caspase-11)蛋白表達水平，引發細胞凋亡[48]。Jiang等[49]研究發現，LPS可加劇衣霉素誘導的細胞內質網應激及細胞凋亡程度。通過siRNA敲除p53蛋白后，細胞凋亡程度得到明顯緩解，這可能是由于p53蛋白可以與GRP78/BiP蛋白互作，調節內質網應激相關信號有關。Yang等[50]研究發現，補充約氏乳桿菌L531(1010CFU/d，7 d)可明顯減輕沙門氏菌誘導的仔豬回腸炎癥水平和腹瀉的發生，改善腸絨毛形態，這種保護作用與其降低腸上皮中內質網應激相關蛋白GRP78表達有關，這可能是益生菌改善豬腸健康的新機制。

3.3 病毒感染與內質網應激

病毒性腹瀉是造成豬腸屏障功能障礙的重要因素，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。其中，流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒是引起豬群腹瀉的3種常見病毒。豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引發的傳染性急性腸病，病理特征表現為嚴重的腸道炎癥、嘔吐和腹瀉，仔豬感染后致死率極高[51]。Xu等[52]發現，豬流行性腹瀉病毒N蛋白可誘導豬腸上皮細胞內質網應激，上調GRP78蛋白表達水平并抑制細胞增殖，提示病毒誘導的腸道損傷與內質網應激信號通路的激活有關。傳染性胃腸炎病毒(TGEV)與豬流行性腹瀉病毒相似，同屬于冠狀病毒科[53]，仔豬受該病毒感染后空腸和回腸絨毛結構損傷，出現腹瀉，嚴重時可致死[54]。先前的研究發現TGEV病毒N蛋白在病毒轉錄過程中發揮重要作用，此外Zhang等[55]試驗結果表明，TGEV病毒N蛋白也可引起豬腸上皮細胞細胞周期S期阻滯和內質網應激。Xue等[56]研究發現，TGEV可誘導IPEC-J2細胞和仔豬小腸發生內質網應激，激活未折疊蛋白反應的3條經典信號通路，細胞試驗結果顯示，被激活的PERK-eIF2α軸通過降低內質網內總蛋白質合成效率與促進干擾素IFN-α/β蛋白表達的方式，抑制TGEV在細胞中的復制。Ma等[57]的試驗研究發現，TGEV通過磷酸化激活IRE1α抑制宿主細胞miR-30a-5p的表達，從而上調了IFN信號轉導的負調控因子(SOCS1和SOCS3)，繼而下調了IFN-α/β的表達。這2項研究分別從不同角度闡述了TGEV誘導豬腸道內質網應激與細胞抗病毒反應的關系，加深了畜牧科技工作者對內質網應激信號通路在TGEV誘導豬腸道損傷中的作用機制的理解。

3.4 霉菌毒素與內質網應激

飼料霉菌毒素污染影響動物生長、發育、繁殖，并影響動物源性食品安全。研究發現，5 μmol/L黃曲霉毒素B1可引發牛乳腺上皮細胞內質網應激并誘導細胞凋亡[58]。Gao等[59]在以Caco-2為模型的研究中發現，黃曲霉毒素M1和赭曲霉毒素A均降低單層細胞跨膜電阻和緊密連接蛋白表達水平，破壞屏障功能。3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇作為嘔吐毒素的乙酰化形式，廣泛存在于霉菌毒素污染的飼料和食品中。長期以來，3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對免疫細胞功能的影響并未受到重視。本團隊最近試驗發現，3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇可誘導巨噬細胞Raw 264.7發生凋亡和DNA損傷，進一步的研究表明，細胞中內質網應激相關蛋白，如ATF6、p-IRE1α和p-eIF2α蛋白表達水平均顯著提高，并激活了細胞自噬性細胞死亡，進而影響機體免疫[60]。此外，鐮刀菌屬細菌產生的玉米赤霉烯酮，也是食品和飼料中常見的污染物[61]。Long等[62]在體外試驗中發現，10 μg/mL花青素可顯著降低玉米赤霉烯酮誘導的小鼠腸道上皮細胞凋亡比例，并且這種保護效果與CHOP、GRP78和JNK蛋白表達水平下降有關。這項研究表明，花青素可能通過抑制內質網應激信號途徑，緩解玉米赤霉烯酮誘導的腸上皮細胞凋亡。因此，通過營養調控手段減少內質網應激對動物腸道帶來的影響，有助于提高動物的屏障功能和整體健康。

4 小 結

腸道健康對于營養物質消化吸收和代謝、動物生長發育和繁殖具有重要影響，并與飼料利用效率和養殖效益密切相關。最近的研究發現，斷奶應激、霉菌毒素污染、細菌和病毒等病原微生物直接或間接作用于腸上皮細胞內質網，引起其功能的紊亂，從細胞器水平揭示了其在腸屏障功能中的重要生理學作用(圖1)。開展宿主細胞-微生物-營養素之間互作機制研究，有助于揭示其潛在的分子機制。

Apoptosos：細胞凋亡；ATF4：轉錄激活因子4 activating transcription factor 4；ATF6：轉錄激活因子6 activating transcription factor 6；ATF6f：轉錄激活因子6片段 transcriptional activator 6 fragment；BiP：葡萄糖調節蛋白 glucose-regulated protein；Bacteria：細菌；Claudins：閉合蛋白；c-JNK：c-Jun N端激酶 c-Jun N-terminal kinase；CHOP：CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白 CCAAT/ enhancer binding protein homologous protein；Endoplasmic reticulum stress：內質網應激；eIF2α：真核翻譯起始因子2的α亞基 eukaryote initiation factor 2α；ERAD signaling：內質網相關蛋白降解信號 ER-associated protein degradation signaling；Golgi：高爾基體 Golgi apparatus；Glucose homeostasis：葡萄糖穩態；IRE1：肌醇酶1 inositol-requiring kinase 1；Inflammatory response：炎癥反應；JNK：c-JNK氨基末端激酶 c-Jun N-terminal kinase；Microvillus：微絨毛；Mycotoxins：霉菌毒素；Misfolded protein：未折疊蛋白；Nucleus：細胞核；Occludin：咬合蛋白；PERK：蛋白激酶R樣內質網激酶 protein kinase RNA-like ER kinase；Protein folding：蛋白折疊；Secretory function：分泌功能；Tight junctions：緊密連接；TRAF2：TNFα受體相關因子2 TNFα receptor-associated factor 2；Viruses：病毒；Weaning stress：斷奶應激；XBP1：X盒結合蛋白 1 X-box-binding protein 1；ZO：胞質緊密連接蛋白 cytoplasmic tight junction protein。