柚皮苷和胃蛋白酶相互作用的光譜研究

楊鑫，徐晶，馬坤，王娜，楊廣德，南冠軍

(1.西安交通大學第二附屬醫院，陜西 西安 710004；2.陜西省人民醫院，陜西 西安 710068；3.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061)

柚皮苷(Naringin，NRG)是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科柚、葡萄柚和酸橙等植物中。柚皮苷具有多種生物學活性，如抗病毒、抗炎、抗過敏、鎮痛等，還能通過調節血液中膽固醇水平，減少血栓從而改善局部微循環，達到防治血管性疾病的目的[1-2]。

胃蛋白酶(Pepsin，Pep)，又稱胃液素，是人類及多數哺乳動物胃腸道內的一種重要消化酶，對人類而言，Pep分子量約為35 kDa， 在37～42 ℃的酸性環境中具有最強活性[3]，主要是通過水解聚氨基酸間的肽鍵鏈接使食物中的蛋白類物質被消化[4]。胃液中的前體物質——胃蛋白酶原,在酸性條件下被激活后形成胃蛋白酶從而發揮作用[5]。胃蛋白酶目前被廣泛應用于各類工業和食品生產中，包括方便食品、奶制品、消化藥及口香糖加工制造，以及啤酒、果酒的澄清應用方面[6]。

天然活性化合物和蛋白質或酶等生物大分子的相互作用研究越來受到關注。小分子化合物與酶等生物大分子相互作用，一方面可能會引起酶的構象改變，影響其活性；另一方面會影響小分子化合物的吸收、轉運等[7]。鑒于NRG廣泛存在于一些水果中，Pep又是重要消化酶;因此有必要研究NRG和Pep的相互作用，從分子水平方面闡明NRG與Pep的作用特點[8-11]。因此本研究將通過研究NRG與Pep的熒光猝滅類型、結合常數K、結合位點數n、作用力類型、Pep構象的變化，結合NRG與Pep的氨基酸殘基的距離r等關鍵參數的研究，并通過測定結合常數隨溫度的變化情況，進一步確定NRG與Pep的作用機制及可能性，為分子水平上研究NRG與Pep的作用特點提供信息[12-15]。

1 儀器與試劑

熒光分光光度計(RF-5310pc，日本島津公司)；紫外分光光度計(UV-2450，日本島津公司)；分析天平(AY120，日本島津公司)；循環恒溫水浴鍋(HWY-501, 上海昌吉地質儀器有限公司)；數顯pH計(PHS-29A，上海儀電科學儀器股份有限公司)；超純水機(1810B，上海摩勒生物科技有限公司)。

Pep(北京索萊寶科技有限公司，分析純)；NRG(西安冠宇生物技術公司，分析純)；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙醇和氯化鈉(西安化學試劑廠，分析純)。

2 方法與結果

2.1 儲備液的配制

2.1.1 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液

先準確稱取檸檬酸21.01 g，然后用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL；準確稱取十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)3.58 g，用蒸餾水溶解定容至50 mL。準確稱取5.85 g NaCl置1 000 mL容量瓶中，加入上述檸檬酸溶液530 mL和十二水合磷酸氫二鈉溶液20 mL，溶解完全后蒸餾水定容。

2.1.2 Pep標準儲備液的配制

準確稱取87.5 mg的Pep置100 mL容量瓶中，使用上述檸檬酸-磷酸鹽緩沖液溶解并定容，得到2.5×10-5mol/L的Pep標準儲備液，4 ℃保存備用。

2.1.3 NRG儲備液的配制

精確稱取10 mg NRG置10 mL容量瓶中，加入乙醇溶解定容，得到1.72×10-3mol/L 的NRG儲備液，4 ℃保存備用。

2.2 試驗方法

2.2.1 NRG與Pep相互作用的紫外吸收光譜

精密量取5 mL Pep標準儲備液，用上述檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液稀釋至濃度為1.25×10-5mol/L，取與Pep相同摩爾濃度的NRG溶液，另取與相同濃度的Pep-NRG混合溶液于37 ℃反應5min后，分別在200～400 nm范圍內掃描紫外光譜。

2.2.2 NRG與Pep相互作用的熒光猝滅光譜

精密量取10 mL 1.25×10-5mol/L Pep稀釋液于比色管中，加入25 μL乙醇，恒溫水浴5 min，取2 mL于比色皿中，將激發波長設為280 nm,并將激發光譜和發射光譜的狹縫寬度設為5 nm，獲得溶液在290 ～ 440 nm范圍內的熒光發射光譜。逐次加入NRG儲備液置比色管中，每次2 μL，掃描后再將比色皿中的溶液倒回，搖勻，置于25 ℃恒溫水浴鍋中，恒溫5 min，重新取該溶液2 mL在原圖上掃描猝滅光譜，并記錄每次掃描的峰值的熒光強度。

將恒溫水浴溫度分別改為30 ℃和37 ℃，重復以上操作。

2.2.3 同步熒光光譜

室溫下，操作方法同“熒光猝滅光譜”。精密量取一定量濃度和體積的Pep稀釋液于比色管中，取2 mL于比色皿中，以Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm測定其同步熒光光譜(Δλ為發射波長與激發波長的差，即Δλ=λem- λex；激發光柵與發射光柵狹縫寬均為5 nm)，逐次加入NRG儲備液于比色管中，每次2 μL，掃描后再將比色皿中的溶液倒回，搖勻，靜置5 min，重復以上操作測定其同步熒光光譜。

2.2.4 三維熒光

室溫下，精密量取一定量濃度和體積的Pep稀釋液于比色管中，取2 mL于比色皿中，將激發波長設置為從220 nm開始，間隔為5 nm，直到400 nm為止，在220 ～ 500 nm范圍內掃描熒光光譜，得出NRG-Pep的三維熒光光譜。

2.3 結果

2.3.1 NRG對Pep的猝滅作用

見圖1,圖1中a、b、c分別為在25、30、37 ℃下NRG對Pep的熒光猝滅光譜。NRG與Pep的相互作用機制可由熒光光譜的變化推斷得出。從圖中可以看出，隨著NRG濃度的增加，峰位和峰形基本不變，而Pep的熒光強度隨NRG濃度的增加而降低，由此可以推測NRG與Pep產生了相互作用。

注：圖中C (Pep) = 1.25×10-5 mol/L，圖中1～11熒光猝滅光譜對應的的C (NRG) = 0、0.34、0.69、1.03、1.38、1.72、2.06、2.41、2.75、3.10、3.44×10-6 mol/L。圖1 在25 ℃ (a)，30 ℃ (b)，37 ℃ (c)不同溫度下NRG對Pep的熒光猝滅光譜

2.3.2 柚皮苷與胃蛋白相互作用的猝滅機理

根據Stern-Volmer方程[16]，即公式(1)，以F0/F為縱坐標，Pep溶液中加入的NRG濃度[Q](×10-6mol/L)為橫坐標作圖，可得到不同溫度情況下NRG對Pep的熒光猝滅曲線，并對曲線做線性回歸，見圖2。

(1)

其中，F0:熒光強度(不加猝滅劑)；F:熒光強度(加入猝滅劑)；Kq:雙分子表觀猝滅常數;τ0:無猝滅劑條件下，熒光分子的平均壽命(約為10～8 s)；[Q]:猝滅劑濃度；Ksv:猝滅速率常數。

以F0/F為縱坐標，猝滅劑濃度[Q]為橫坐標，繪制Stern-Volmer曲線，回歸方程的斜率即為Ksv，同時求得Kq。

Ksv隨測試溫度升高而升高，見表1,初步推斷NRG對Pep的猝滅機制為動態猝滅。此外，由于雙分子表觀猝滅常數Kq值均遠大于最大擴散碰撞猝滅常數2.0×1010L/(mol·s)，說明引起熒光體熒光猝滅的主要原因可能是形成了新的配合物，猝滅機理為靜態猝滅，所以可以推出Pep的熒光猝滅可能不是分子擴散和碰撞引起的動態猝滅，而是形成新的復合物引起的復合式靜態猝滅。

注：●表示25 ℃;█表示30 ℃;▲表示37 ℃。圖2 在不同溫度下NRG對Pep的熒光猝滅曲線

表1 NRG對Pep的Stern-Volmer回歸方程及猝滅常數

2.3.3 柚皮苷與胃蛋白酶的結合常數和結合位點數

根據公式(2)計算NRG與Pep的結合位點數。用lg[(F0-F)/F] 對lg[Q] 作雙對數圖，對數據作線性擬合，直線斜率即為不同溫度下NRG與Pep的結合位點數。結果如圖3所示，并將其相關系數列于表2中。

(2)

注：●表示25 ℃；█表示30 ℃；▲表示37 ℃。圖3 不同溫度下NRG對Pep熒光猝滅的雙對數曲線

表2 NRG與Pep的結合常數和結合位點數

由斜率知，NRG與Pep的結合位點數n≈1下，二者結合時，存在約1個單獨的結合位點，即大約1個NRG分子與1個Pep分子結合形成配合物。

2.3.4 柚皮苷與胃蛋白酶相互作用的作用力類型

用對應溫度下的結合常數的自然對數lnK對1/T作圖，線性擬合得到圖4，再根據公式(3)和(4)，可計算得到結合反應的ΔG，ΔH，ΔS等熱力學函數的變化值，所得結果見表3。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(4)

式中K表示溫度為T時的結合常數；T表示絕對溫度；R表示普適氣體常量；ΔG表示反應的標準摩爾吉布斯自由能變；ΔH表示反應焓變；ΔS表示反應熵變。

藥物分子與蛋白質作用力類型可以根據ΔH和ΔS的值來判斷：若ΔH>0，ΔS>0，則是典型的疏水作用力；若ΔH<0，ΔS>0，則是靜電作用力；若ΔH<0，ΔS<0，則表明是氫鍵和范德華力；若ΔG<0，則表明反應過程是自發進行的。

圖4 NRG對1/T的線性關系

由表3可知，NRG-Pep結合體系的ΔH>0，ΔS>0，NRG與Pep分子間存在的相互作用力為疏水作用力。ΔG<0表明NRG與Pep的結合是自由能降低的分子作用過程，說明NRG可以自發地與Pep相結合。

表3 NRG與Pep結合的熱力學常數

2.3.5 NRG對Pep構象的影響

NRG對Pep構象見圖5。

注：圖中Δλ=15 nm (a)，Δλ= 60 nm (b)，C (Pep) = 1.25×10-5 mol/L；圖中1～11對應的的C (NRG) = 0、0.34、0.69、1.03、1.38、1.72、2.06、2.41、2.75、3.10、3.44×10-6 mol/L。圖5 室溫下NRG對Pep的同步熒光光譜

圖5中的a和b分別為在室溫條件下，Pep在Δλ=15 nm (酪氨酸殘基)和Δλ=60 nm (色氨酸殘基)的同步熒光光譜。隨著NRG濃度增大，Pep同步熒光強度逐漸降低。其中，色氨酸殘基的熒光強度降低的幅度較大，表明Pep的熒光強度可能主要來自色氨酸殘基，其最大發射波長發生了藍移，表明色胺酸殘基環境的疏水性增大，Pep趨向折疊態，因此Pep的構型發生了變化。

2.3.6 柚皮苷對胃蛋白酶紫外吸收光譜的影響

NRG與Pep反應后在波長280 nm處有最大吸收峰，加入NRG后，Pep紫外吸收光譜發生了明顯紅移，表明NRG與Pep形成了新的復合物。見圖6。

注：圖中C (Pep) = 1.25×10-5 mol/L，C (Pep) =C (NRG) = 1.25×10-5 mol/L; a. NRG; b. NRG-Try; c. Try; d. b-a。圖6 NRG與Pep相互作用的紫外吸收光譜

2.3.7 柚皮苷與胃蛋白酶之間的能量轉移

小分子物質與熒光發射基團間的能量轉移效率E和結合距離r可由公式(5)計算得出：

(5)

其中E為能量轉移效率，F0和F分別表示不加猝滅劑和加入猝滅劑后蛋白的熒光強度，R0表示轉移效率為50%時的臨界距離，r為小分子藥物與蛋白的熒光發射基團的距離。R0可由公式(6)計算得出:

(6)

式中K2表示偶極空間取向因子，N表示介質的折射指數，Φ表示供能體的熒光量子產率，J表示供能體的熒光發射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊積分，可由公式(7)計算得出：

(7)

F(λ)表示供能體在波長λ處的熒光強度，ε(λ)表示受能體在波長λ處的摩爾吸光系數，K2=2/3，N=1.336，Φ=0.15；可由公式5～7式計算得出J，R0，和r值。當供能體與受能體間的距離小于7 nm時，表明蛋白與小分子藥物之間發生了能量轉移。

供能體Pep的熒光光譜圖與受能體NRG的紫外吸收光譜圖有重疊，根據F?rster非輻射能量轉移原理，可計算出NRG在Pep上的結合位置距色氨酸殘基的距離r=2.44 nm (<7 nm)，表明Pep與NRG之間可能存在能量轉移。見圖7，表4。

表4 NRG與Pep間的能量轉移參數

2.3.8 柚皮苷與胃蛋白酶之間的三維熒光

三維圖a為Pep三維熒光，三維圖b為NRG-Pep三維熒光，可以看出NRG-Pep峰強度降低，表示了NRG和Pep之間有相互作用。見圖8。

圖8 胃蛋白酶和柚皮苷的三維熒光圖

3 討論

NRG能顯著猝滅Pep的熒光，熒光猝滅實驗結果表明，NRG與Pep的作用機制為(復合式)靜態猝滅[17]。NRG與Pep結合時約存在1個單獨的結合位點，即大約1個NRG分子與1個Pep分子結合形成配合物，隨著溫度的升高，結合常數也增大，37 ℃時，NRG與Pep的結合常數最大為3.40×105。通過Vant Hoff方程計算得出，NRG與Pep間的作用力類型為疏水作用力，NRG與Pep的結合是自由能降低的分子作用過程，NRG可以自發地與Pep相結合。

根據同步熒光光譜表明，NRG在與Pep作用時，Pep構象發生了一定程度的變化[13]。紫外吸收光譜的變化表明NRG與Pep之形成了不發光的復合物，進而導致熒光吸收光譜變化，同時，F?rster非輻射能量轉移原理表明，NRG與Pep之間存在著能量轉移現象，進一步證實了NRG和Pep之間存在以靜態猝滅發生相互作用的可能[18]。

通過建立植物活性成分與酶結合的體外模型，得到了兩者結合的緊密程度、結合部位、結合作用力、結合位點數等信息，不僅有助于在分子水平上認識蛋白質和藥物的相互作用，獲得藥物結合生物大分子的基本信息，還可以提供藥物藥效學和藥動學的相關信息。

NRG與Pep的相互作用機制可由熒光光譜的變化推斷得出，NRG與Pep產生了相互作用或自發結合，Pep的熒光猝滅可能是形成新的復合物引起的復合式靜態猝滅，大約1個NRG分子與1個Pep分子結合形成配合物并伴隨能量轉移。