康益膠囊對大鼠腦缺血再灌注神經功能損傷及氧化應激的影響

丁培娜，崔應麟，王雪可，陳冠廷

(1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450000；2.河南省中醫院，河南 鄭州 450002)

缺血性腦血管疾病已經成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。對于腦血管疾病的治療，及早恢復缺血腦組織血流灌注、改善局部供氧，是降低其病死率、致殘率的重要手段之一。但在恢復血流灌注后, 則可能出現更為嚴重的腦組織結構及功能的損害, 稱為缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion, I/R)[1]。因此，腦缺血再灌注損傷后的診療，受到越來越多的重視,而中藥制劑在此方面，獲得了顯著的療效[2]。腦梗死屬中風的范疇，究其病因病機，主要是以虛為本，以風、痰、瘀、火為標，其中又以氣虛致脈道不利、瘀血阻絡為多見[3]。康益膠囊是在前人基礎上，結合多年臨床經驗，針對中風病因病機特點，篩選的有效藥物組成，具有益氣活血、通絡祛濁之功效。

本實驗采取線栓法制備大鼠大腦中動脈急性腦梗死模型，主要觀察康益膠囊對腦缺血再灌注損傷后大鼠神經功能缺損癥狀、腦組織氧化應激水平的影響，探討康益膠囊的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康Wistar雄性大鼠80只，體質量(210±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產合格證號:SCXK(京)2016-0011。大鼠分籠喂養，在室溫20～25 ℃、相對濕度40%～60%、自然光照情況下給予充足的水和食物，自然晝夜循環。所有動物實驗經河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)倫理委員會批準后進行。

1.2 儀器與試劑

水合氯醛(北京索萊寶科技有限公司, 批號：T8590)；CPA324S型電子天平 (北京賽多利斯儀器系統有限公司)； H1650型離心機 (湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；5417型低溫高速離心機(Eppendorf公司)；脫水機(德國 LEICA AS P300)；谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、 過氧化物酶(LDH)(南京建成生物工程研究所)。

1.3 藥物

康益膠囊(由河南省中醫院自制)是依據急性中風的病因病機特點，由紅參、丹參、三七、土鱉蟲、水蛭、大黃按照1∶3∶1∶2∶1∶0.6的比例研末配制而成,具有益氣活血、通絡祛濁之功效；銀杏葉片(揚子江藥業集團有限公司，國藥準字Z20027949，9.6 mg∶2.4 mg/片)。兩種藥物均配置成混懸液，4 ℃保存備用。

2 方法

2.1 模型制備

參考Longa的實驗方法[4]，略作改良后制備大鼠大腦中動脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。所有大鼠禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后的大鼠，仰臥位固定在手術板上，頸正中線開口，逐層分離，暴露右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，避免刺激迷走神經。在CCA近心端和ECA近端、緊鄰分叉處各置一根絲線并結扎，用動脈夾夾閉頸內動脈，在CCA上距ICA、CCA分叉4 mm地方剪一“V”形切口，將栓線圓鈍端沿切口插入ICA，緩緩向前推進18～20 mm，稍遇阻力即停止前進。結扎，固定栓線和防止出血，逐層縫合傷口，栓線末端留1 cm于皮外。2 h后拔出線拴，形成再灌注。假手術組的大鼠不插入線拴，只分離血管。

按照Zea-Longa′s五級標準評分法，術后2 h對大鼠進行神經行為癥狀評分。評分方法見表1。評分在1～3分者為造模成功，評分為0分、4分及生命體征不平穩的動物剔除。

表1 Zea Longa's五級標準評分法

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機分為假手術組、模型組、康益膠囊低劑量組和康益膠囊中劑量組、康益膠囊高劑量組和銀杏葉組,共6組，每組12只。結合前期的預實驗結果，各組給藥劑量按照人和大鼠體表面積換算，人與大鼠的換算系數為0.018[5]，康益膠囊低劑量組給予75 mg/kg混懸液，康益膠囊中劑量組給予150 mg/kg混懸液，康益膠囊高劑量組給予300 mg/kg混懸液，陽性藥物組給予銀杏葉片150 mg/kg混懸液，模型組、假手術組則灌胃相同體積的溶劑對照。再灌注后24 h開始灌胃給藥，每日1次，連續灌胃14 d。

2.3 評價指標

2.3.1 一般情況觀察

實驗期間每天觀察并記錄大鼠活動、飲食情況、精神狀況、體質量變化等。

2.3.2 神經行為恢復評分

采用改良神經功能評分(mNSS)[6]評估康益膠囊對腦缺血再灌注大鼠神經功能恢復的影響。于術后24 h、第3天、第7天、第14天分別評分，每次固定在同一時間點完成。mNSS總分為18分，神經功能損傷程度隨分值增大而加重，其中0～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

2.3.3 大鼠腦組織中的含水量

第14天評分后，每組大鼠隨機選取6只，麻醉后斷頭取腦，剝離腦組織，生理鹽水沖洗，嗅球、低位腦干及小腦去除，用濾紙吸干水分后稱重(腦濕重)。置于100 ℃的烘箱中烘烤 24 h后再稱重(腦干重)[7]。

腦組織含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%

2.3.4 大鼠腦組織中CAT、GSH-Px活性和LDH含量的檢測

將各組剩余6只大鼠，處死后斷頭取腦，冰盒內快速分離大腦，取部分右側大腦半球，準確稱重后，按照1∶9的比例加入預冷至4 ℃的生理鹽水，在冰上研磨制備成10%組織勻漿，然后在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液。分別按試劑盒說明書測定CAT、GSH-Px的活性和LDH含量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 一般情況

康益膠囊各劑量組灌胃期間，大鼠活動、精神、飲食、體質量與余組大鼠無明顯差異。

3.2 大鼠神經功能評分(mNSS)比較

假手術組沒有神經功能缺損；灌胃前，其余各組間神經功能評分無明顯差異(P>0.05)。灌胃14 d后，模型組神經功能缺損改善不明顯；康益膠囊低、中、高劑量組和銀杏葉組神經功能缺損評分較模型組均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；高劑量組較銀杏葉組改善更明顯(P<0.01)。結果見表2。

表2 各組大鼠神經功能mNSS評分比較分)

3.3 大鼠腦組織含水量的比較

模型組大鼠的腦組織含水量均明顯升高，與假手術組比較有顯著性差異(P<0.01);康益膠囊低、中、高劑量組較模型組腦含水量明顯降低 (P<0.05，P<0.01)；高劑量組與銀杏葉組比較無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 各組大鼠腦缺血后腦組織含水量的比較

3.4 大鼠腦缺血再灌注腦組織CAT、GSH-Px活性的比較

與假手術組相比，模型組CAT、GSH-Px的活性顯著下降 (P<0.01);康益膠囊中劑量組及高劑量組CAT活性明顯高于模型組 (P<0.05) ;康益膠囊各組及銀杏葉組GSH-Px活性明顯高于模型組 (P<0.05，P<0.01)。結果見表4。

表4 各組大鼠腦缺血再灌注腦組織CAT、GSH-Px活性的比較

3.5 大鼠腦缺血再灌注腦組織中LDH水平的比較

與假手術組相比，模型組LDH的含有量顯著增加(P<0.01)；康益膠囊各組及銀杏葉組LDH的含量明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。結果見表5。

表5 各組大鼠腦缺血再灌注腦組織LDH含量的比較

4 討論

腦梗死后局部腦組織缺血和缺氧，進一步引起病灶處組織軟化、壞死，導致神經功能缺損。及時恢復血流灌注是目前最佳治療方案。研究顯示[8]，再灌注治療可拯救即將死亡的細胞，在功能上恢復可逆性損傷，但大量自由基的生成、氧化應激的激活等仍會持續損傷腦組織進而導致神經功能缺損癥狀。在健康狀態下，腦內存在抗氧化系統，使腦內的氧化作用與抗氧化作用處于平衡狀態，保證神經系統功能正常，其中的酶抗氧化系統，包括有CAT、GSH-Px等，它們在自由基的生成、清除及過氧化鏈式反應的中止等方面發揮著重要作用。腦缺血再灌注損傷時，自由基就會大量生成，同時自由基清除酶活性也會下降，導致自由基清除率降低，自由基大量蓄積，體內抗氧化能力紊亂，損害腦神經功能[9-11]。大量自由基作用于脂質發生過氧化反應，致使蛋白質和核酸等生物大分子氧化損壞，蛋白質氧化引起蛋白質羥基的生成[12-13]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是人體內的自由基清除酶、水溶性過氧化物分解酶，可以起神經保護的作用，其活性能夠反映機體自由基清除的能力[14]；過氧化氫酶(CAT) 是具有還原活性的抗氧化酶，能減輕脂質過氧化損傷，其活性可以反應氧化應激反應的激活狀態[15]；腦細胞在急性缺氧狀態會釋放大量乳酸脫氫酶(LDH)，LDH可作為反映神經元損傷情況的指標[16]。本實驗研究表明，大鼠在腦缺血再灌注后，神經功能缺損癥狀明顯，腦水腫顯著，腦組織中自由基清除酶如CAT、GSH-Px的活性明顯降低，LDH含量明顯升高，腦損傷明顯。

本實驗研究結果顯示，康益膠囊可明顯促進大鼠腦缺血再灌注后神經功能缺損癥狀的恢復;顯著降低腦組織含水量;提高MCAO 后大鼠腦組織中CAT、GSH-Px等的活性，明顯降低LDH的含量。可見，康益膠囊具有明顯的修復神經功能缺損、降腦水腫和抗氧化的作用，對大鼠缺血性損傷起到修復作用。