竹林金針蟲實時熒光定量PCR內參基因的篩選與應用

葉碧歡，陳友吾，舒金平，張 威，張亞波，李海波，宋其巖

（1.浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；2.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400）

竹林金針蟲是取食竹筍的叩甲幼蟲的總稱，蟲害發生時竹筍產量顯著減少，嚴重時竹種無法成竹，制約了竹林的自然更新[1?2]。篩胸梳爪叩甲Melanotuscribricollis隸屬于鞘翅目Coleoptera叩甲科Elateridae梳爪叩甲屬Melanotus，其幼蟲為中國南方早園竹Phyllostachyspropinqua竹林的優勢種。化學藥劑防治竹林金針蟲易造成環境污染、抗藥性和食品安全等問題，阻礙以“生態、健康、有機”為標簽的林產品產業發展，因此近年來逐漸采用生物技術防治該蟲害。綠僵菌Metarhiziumsp.是常見的昆蟲致病真菌[3?4]，對鞘翅目和鱗翅目Lepidoptera等害蟲均有一定防效[5?6]。研究竹林金針蟲抗綠僵菌相關基因的表達有利于深入了解害蟲免疫抗性機制和蟲菌互作機制，也有利于生防菌菌株改造等研究，提高其對農林害蟲防治的效果。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)是研究基因表達分析的關鍵技術，省時、高效、應用廣泛；為保證目的基因定量表達結果的準確性，需引入表達穩定的內參基因作為參照[7]。內參基因又稱看家基因，理想的內參基因其表達水平應在各條件下保持穩定，而實際上不同條件下許多內參基因的表達并不穩定[8?9]。因此，即使是同一物種，不同試驗條件下的內參基因也不能一概而用，qRTPCR試驗之前應對所選內參基因的表達穩定性進行評估。常用的qRT-PCR內參基因包括ACT(肌動蛋白)、TUB(微管蛋白)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、UBC(泛素結合酶)、18S rRNA (核糖體蛋白S18)、28S rRNA (核糖體蛋白 S28)、EF1 (延伸因子 1)、SYN1 (突觸融合蛋白 1)、SYN6 (突觸融合蛋白6)、RPS3 (核糖體蛋白 S3)、PRS20 (泛素-核糖體蛋白 S20)、PRS27a(泛素-核糖體蛋白 S27a)、RPL10 (核糖體蛋白 L10)、RPL13α(核糖體蛋白 S13α)、AK(精氨酸激酶)和V-ATPase(液泡型 ATP 合酶)等。符偉等[10]分析了小菜蛾Plutellaxylostella候選內參基因在Bt毒素誘導時的表達穩定性，最終篩選出由PRS13、RPL32和EF1α組成的最佳內參基因組合。馮波等[11]篩選出最適合校正松墨天牛Monochamus alternatus化學感受組織基因表達的GAPDH和TUB內參基因組合。劉金泊[12]評價了赤擬谷盜Tribolium castaneum的候選內參基因在磷化氫誘導條件下的表達穩定性，篩選出RPS18和RPL13α最佳內參基因組合。楊苓等[13]篩選出了適合桃蛀螟Conogethespunctiferalis不同發育時期和不同組織的基因表達研究的2組最佳內參組合(RP49和GAPDH，RPL13和RP49)。陶蓉等[14]則分別篩選出了美國白蛾Hyphantria cunea不同發育階段、不同溫度和不同組織的3組最佳內參基因(RPL12和EF1β，EF1α和GAPDH，ACT和RPS16)。目前，關于篩胸梳爪叩甲幼蟲內參基因的篩選評估尚未見報道。本研究對平沙綠僵菌Metarhiziumpingshaense侵染不同時期的篩胸梳爪叩甲幼蟲qRT-PCR內參基因進行了篩選和評估，以期選出最佳的內參基因，為今后開展竹林金針蟲等昆蟲的基因表達研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源、真菌和土壤

供試篩胸梳爪叩甲幼蟲于2020年3月下旬至4月中旬采自浙江省湖州市德清縣的早園竹林地，帶回室內置于塑料養蟲箱中，箱內裝滿約3/4的土壤(濕度為10% ± 1%)，定期喂以鮮筍。供試平沙綠僵菌WP08菌株由中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所森林保護團隊提供，該菌株最初從僵死的篩胸梳爪叩甲幼蟲蟲體上分離獲得[15]。WP08菌株接種于PDA培養基，產孢3周左右收集分生孢子。供試土壤采自德清早園竹園區，40 目的網篩過篩，高溫滅菌(121 ℃、1 h)，烘干備用。

1.2 樣品處理

取一定量的平沙綠僵菌WP08分生孢子與供試土壤，混勻后調節土壤水分為(10 ± 1)%，土壤孢子密度為1.1×107個·g?1。挑選活力強且個體大小一致的幼蟲置于處理樣品中，培養至7、12和 17 d時取樣，以未經綠僵菌侵染處理的幼蟲作為對照組(0 d)，隨機取樣5頭·份?1。試驗在人工氣候培養箱中進行，溫度設定為(25 ± 1) ℃，空氣相對濕度為(80 ± 10)%，黑暗條件，設置3個生物學重復。所有樣品用無菌水清洗數遍，用體積分數75%的乙醇表面消毒后，再用無菌水清洗1遍；無菌濾紙吸干蟲體體表水分，液氮速凍，存放于?80 ℃備用。

1.3 總 RNA 提取和 cDNA 合成

利用景新微量動物組織總RNA提取試劑盒(SIMGEN，杭州)提取不同樣品的RNA，具體操作參照試劑盒說明書。利用質量濃度1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(美國Thermo Scientific)檢測所提取總RNA的質量和質量濃度。利用無菌雙蒸水(ddH2O)將所有樣品RNA稀釋到125 mg·L?1備用。按照 PrimeScriptTMReagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒 (Takara)說明書合成樣品cDNA，每個樣品取 7.0 μL RNA。

1.4 引物設計、合成和篩選

參考昆蟲常用內參基因，根據篩胸梳爪叩甲幼蟲的轉錄組測序注釋結果[16]，篩選不同內參基因(βactin、α-tubulin、GAPDH、AK、SYN6、RPS3、RPL13α、RPL10、RPS27a、RPL32、RPS20 和EF-1α)的同源序列，同時篩選昆蟲免疫應答相關基因的6個同源序列[PGRP、Prx、SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和SDR(4)]，并利用在線網站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/針對基因開放閱讀框(ORF)區設計qRTPCR擴增引物。所有引物均由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

以cDNA(0 d)為模板進行普通PCR擴增，并根據電泳結果篩選出擴增條帶單一的特異性引物對。PCR 擴增反應體系為：2×TSINGKE Master Mix 10.0 μL，上下游引物 (10 μmol·L?1)各 1.5 μL，模板cDNA 3.0 μL，ddH2O 補足至 20.0 μL。擴增程序為：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，退火 55 ℃，72 ℃延伸2 min，共35個循環；最后于72 ℃補平7 min，終止溫度為4 ℃。PCR擴增反應在LifeECO基因擴增儀(杭州博日)上進行。取PCR擴增產物3.0 μL，點樣于質量濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上，TS-GelRed核酸染料染色，1×TAE緩沖液中電泳30～40 min(120 V)，利用Bio-Rad凝膠成像分析儀(美國伯樂)攝取擴增圖譜。

1.5 標準曲線構建及引物擴增效率分析

標準曲線構建。將反轉錄獲得的cDNA(0 d)稀釋2倍后，再依次稀釋5個梯度，各梯度依次稀釋5倍。以梯度稀釋的cDNA為模板進行qRT-PCR，反應在Line Gene 9600 Plus實時熒光定量PCR儀(杭州博日)上進行，使用 Gene-9660 software 采集數據。PCR 擴增反應體系為：2×SYBR Green Mix 5.0 μL，上下游引物 (5 μmol·L?1)各 0.2 μL，模板 cDNA 1.0 μL，ddH2O 補足至 10.0 μL。qRT-PCR 擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40個循環，60 ℃采集熒光信號。擴增結束后做熔解曲線分析以檢測擴增產物的特異性。熔解曲線程序：95 ℃，15 s；65 ℃，1 min；95 ℃，20 s，隔 20 s步進 0.2 ℃；30 ℃，1 min。各樣品進行 3 次技術重復，取循環閾值 (cycle threshold，Ct)的平均值。判斷每對引物是否具有特異性以及是否有引物二聚體，熔解曲線為單峰時用于后續分析。

擴增效率分析。利用SPSS 19.0軟件分析cDNA模板質量濃度(對數值)和Ct值的線性關系，獲得相關系數(R2)和斜率(S)，利用公式E=(10?1/S?1)×100%計算引物的擴增效率[17]。

1.6 內參基因表達穩定性分析

以0(ck)、7、12和17 d取樣的cDNA為模板，利用1.4節篩選出的引物對進行qRT-PCR，具體程序同1.4節所述。利用Excel 2003，GeNorm[18]、Normfinder[19]和Bestkeeper[20]軟件根據Ct平均值分析候選內參基因的表達穩定性。GeNorm根據表達穩定度(M值)大小對候選內參基因進行排序，M值越小表示基因表達越穩定；根據標準化因子的配對差異分析(Vn/n+1)判定最佳的內參基因數組，Vn/n+1＜0.15代表該條件下內參基因最佳數目為n個。Bestkeeper軟件通過標準差(SD)和概率值(P)直接分析Ct值，SD＞1或者P＞0.05時，判定該基因不適合作為內參基因。具體操作方法參考文獻[21]。

1.7 內參基因表達穩定性驗證

選擇免疫應答相關基因的6個同源序列作為目的基因，分析1.6節選出的內參基因在不同處理間(0、7、12和17 d)的相對表達量變化，以驗證其表達穩定性。目的基因相對表達量的計算采用2???Ct法。其中：ΔΔCt=ΔCt-實驗?ΔCt-對照，△Ct=Ct-目的基因?Ct-內參基因。采用統計學單因素方差分析及最小顯著性差異法(LSD)多重比較分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 總 RNA 提取

由圖1可見：所有樣品D(260)/D(280)均為1.8～2.1，凝膠電泳結果可見2條清晰條帶(28S和18S rRNA)，說明總RNA較為完整，未出現明顯降解。

圖 1 總 RNA 電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of total RNA

2.2 引物特異性和擴增效率分析

根據篩胸梳爪叩甲幼蟲的轉錄組測序數據，篩選出24條候選內參基因和6條目的基因的同源序列，根據普通PCR擴增結果選出條帶單一的22對特異性引物，再根據qRT-PCR的引物熔解曲線、R2和擴增效率進一步篩選出6對內參基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS27a和RPS3)和6對目的基因的引物。12對引物的熔解曲線均為單峰，R2為0.989～0.998，擴增效率為88.69%～112.48%，表明引物具有特異性，cDNA的質量濃度和Ct值存在明確的線性關系，引物擴增效率符合熒光定量要求 (表 1)。

表 1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Informations of qRT-PCR primers

2.3 內參基因表達穩定性分析

2.3.1 內參基因的表達水平分析 不同平沙綠僵菌侵染處理時長 (0、7、12 和 17 d)下，篩胸梳爪叩甲幼蟲6個候選內參基因的Ct值為11.110～15.463(圖2)，表明本試驗條件下所選內參基因表達水平較高。但不同基因的Ct值存在差異，其中β-actin最低，平均Ct值為11.622；α-tubulin最高，平均Ct值為14.712；GAPDH的Ct值跨度最小(13.273～13.873)；RPS3跨度最大(13.720～14.970)。

圖 2 篩胸梳爪叩甲幼蟲候選內參基因的 Ct值分析 Figure 2 Ct value analysis of candidate reference genes of Melanotus cribricollis larvae

2.3.2 內參基因表達穩定性分析和最佳數量評估 GeNorm 軟件計算基因的表達穩定度(M值)，M＞1.5的內參基因不可用，M越小，內參基因的表達越穩定。該軟件分析結果顯示：6個候選內參基因的M值均＜1.5，PRS27a和RPS3的表達最穩定，其后依次是α-tubulin、RPL13α和β-actin，GAPDH的表達最不穩定。NormFinder通過比較樣本的組內變異和組間變異來評估基因的穩定值。該軟件分析結果顯示：RPL13α的表達最穩定，其后依次是αtubulin、RPS3、RPS27a和β-actin，GAPDH的表達最不穩定。BestKeeper是以標準差和P來判斷內參基因是否可用。該軟件分析結果顯示：所有候選內參基因的標準差均＜1，但β-actin和GAPDH P＞0.05，不適合作為本試驗條件下的內參，其余4個內參基因可用。綜合3個軟件的評價結果發現：RPS3、PRS27a、RPL13α和α-tubulin這 4個內參的表達穩定性排名稍有差異，RPS3的表達最穩定，PRS27a和RPL13α次之，隨后是α-tubulin(表2)。GeNorm軟件通過判斷配對變異值(＜0.15)來確定內參基因最佳數目。由表3可知：V2/3=0.084＜0.15，表明該條件下最佳內參基因的數目n=2(表3)。

表 2 利用 BestKeeper 軟件評價候選內參基因的表達穩定性Table 2 Stability of candidate reference genes based on BestKeeper analysis

表 3 內參基因的最佳數量評估Table 3 Determination of the optimal number of reference genes for normalization

2.3.3 內參基因表達穩定性驗證 綜合 3 款軟件的內參基因表達穩定性排名和最佳組合數目分析結果，本研究選擇PRS27a和RPS3為內參基因。由圖3可知：以PRS27a和RPS3為內參基因時，6個目的基因在平沙綠僵菌不同處理時間(0、7、12和17 d)的篩胸梳爪叩甲幼蟲中的表達變化趨勢相同；其中，PGRP基因相對表達量在7 d時都較對照(0 d)顯著提高 (P＜0.05)，隨后下降，12 和 17 d 時無顯著差異；Prx基因相對表達量整體呈上升趨勢，在12 和 17 d 時均顯著高于對照 (P＜0.05)；SDR(1)相對表達量則呈下降趨勢；SDR(2)在17 d 時相對表達量顯著升高(P＜0.05)；SDR(3)和SDR(4)相對表達量均先升高后下降，并在12 d時表達量最高，較其他處理時間存在顯著性差異(P＜0.05)。

圖 3 以PRS27a和RPS3為內參時6個目的基因不同處理時間下的相對表達量Figure 3 Expression analysis of six target genes under different processing times calibrated by PRS27a and RPS3 as reference genes

3 討論

實時熒光定量PCR具有快速、準確和靈敏的特性，在基因表達分析研究中應用廣泛，然而表達穩定的內參基因選擇是獲得目的基因準確表達結果的前提條件。同一內參基因在不同物種、組織、發育階段和處理條件下的表達穩定性也存在差異[8?9]。目前尚未見有關篩胸梳爪叩甲幼蟲內參基因的研究報道。本研究首次對該蟲在平沙綠僵菌侵染條件下的候選內參基因進行了篩選評估。GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對候選內參基因的分析結果表明：PRS27a和RPS3的表達穩定。本研究以PGRP、Prx、SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和SDR(4)為目的基因對PRS27a和RPS3內參基因進行了驗證，結果顯示：分別以這2個基因為內參時，6個目的基因的表達趨勢一致，證明了這2個基因作為內參的可靠性。PGRP隸屬于模式識別受體蛋白(pattern recognition receptor proteins，PRRs)家族，可與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的肽聚糖結合，激活Toll和Imd信號轉導通路，誘導免疫防御相關的水解級聯反應，發生吞噬作用[22?23]。以PRS27a和RPS3為內參時，目的基因PGRP在篩胸梳爪叩甲幼蟲體內被平沙綠僵菌誘導表達，7 d時較對照組顯著升高，該現象與赤擬谷盜和油菜花露尾甲MeligethesaeneusPGRP基因被寄生物或病原菌誘導后表達上調相似[24?25]。Prx基因編碼過氧化物還原酶(peroxiredoxin)，是抗氧化家族中的一員，能夠通過消除細胞內的活性氧(ROS)以維持氧化還原平衡[26]。以PRS27a和RPS3為內參時，目的基因Prx整體表達呈上升趨勢，推測其可能在病程后期發揮作用。SDR蛋白(short-chain dehydrogenases/reductases，短鏈脫氫還原酶)是一個超級家族，由多種酶編碼基因家族組成，在多種生物合成途徑、細胞信號通路和病理途徑中都扮演重要角色[27]。本研究發現：篩胸梳爪叩甲幼蟲4個SDR基因[SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和SDR(4)]對綠僵菌侵染的響應機制不同，可能是因為參與過程不同。由上可見，以PRS27a和RPS3為內參時，篩胸梳爪叩甲幼蟲PGRP、Prx和SDR這3類基因的表達模式符合赤擬谷盜和油菜花露尾甲等昆蟲對病原菌的響應機制，進一步證實了該內參組合適用于綠僵菌侵染條件下的目的基因表達水平研究。

本研究首次報道了在平沙綠僵菌侵染條件下篩胸梳爪叩甲幼蟲可用的內參基因(PRS27a和RPS3)，為后續研究綠僵菌和竹林金針蟲互作相關基因的表達奠定基礎，也對其他昆蟲基因表達以及蟲菌互作相關研究提供參考。