柚皮素促進Nrf2/Ⅱ相解毒酶活性并降低血管炎癥反應

董豆豆，張 蕓，何 慧，雷霆雯，歐海龍

(貴州醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，貴州 貴陽 550025)

柚皮素(naringenin)即4′, 5, 7-三羥基黃烷酮(4′, 5, 7-trihydroxyflavanone)屬于二氫黃酮類化合物，是柑橘屬植物的次生代謝產物。柚皮素作為柚皮苷的苷元，廣泛存在于檸檬、橘子、胡柚等天然產物的果皮和果肉中。柚皮素具有消炎、抗氧化等多種生物學、藥理學活性[1]。動物實驗結果證實，柚皮素對于多種疾病，如糖尿病、肥胖、高血壓癌癥、神經退化、腎損傷等具有良好的預防和保護作用[2-3]。研究發現，柚皮素還可以改善血脂，降低肝臟脂質積累，減少動脈粥樣硬化斑塊形成[4]。

藥物以及其他的外源性物質在體內代謝過程中，經過氧化、還原及水解等第一相反應外，經常還要與極性更強的葡萄糖醛酸、硫酸等結合，提高溶解度，即第二相反應，參與反應的酶統稱為Ⅱ相解毒酶。核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是應激誘導的的轉錄因子，在維護機體氧化還原平衡過程中起著關鍵作用[5]。在細胞的正常狀態時，無活性的Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)結合而被泛素化并降解；細胞應激產生時，Nrf2被釋放、移入核內，與DNA上的抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結合，啟動下游抗氧化靶基因的轉錄[5]。藥物代謝過程中的Ⅱ相解毒酶如NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase1，NQO-1)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)和谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)等均受Nrf2調控[5]。

動脈粥樣硬化病變的發生、發展與機體炎癥關系密切。在病變早期，多余脂質以氧化的低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein，ox-LDL)形式沉積在血管壁，誘發血管炎癥，使單核/巨噬細胞、平滑肌細胞向內膜間隙遷移，促進斑塊的形成。在病變末期，血管炎癥降低斑塊的纖維帽、使斑塊不穩定。所以，降低血管炎癥可有效抑制動脈粥樣硬化的發生與發展。本研究擬分析柚皮素對Nrf2介導的Ⅱ相解毒酶活性的調節作用；同時利用載脂蛋白E(apolipoprotein,apoE)基因敲除的動脈粥樣硬化模型小鼠(apoE-/-)作為實驗動物，分析柚皮素對主動脈血管炎癥的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑巨噬細胞系RAW264.7細胞購于中科院細胞庫(貨號：TCM13)；DMEM培養基購于Gibco(批號：8120206)；血清購于杭州四季青公司(批號：20090301)；NQO-1(批號：00091222)、GST(批號：00056400)、GCLc(批號：00091423)和GCLm(批號：00091314)等抗體購自武漢三鷹公司、各種酶活性檢測試劑盒購自南京建成公司；ECL發光液(貨號：P0018M)購自江蘇碧云天公司；apoE-/-小鼠(貨號：J002052)購置于南京大學模式動物研究所；其他生物試劑使用國產試劑。

1.2 細胞培養RAW264.7巨噬細胞培養在含10% 胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃，5% CO2環境中培養。當細胞生長70%左右融合度時，進行分組，并分別處理24 h：用50 mg·L-1, ox-LDL孵育，使其轉變為荷脂細胞[6]；ox-LDL(50 mg·L-1)與不同濃度柚皮素(10 μmol·L-1和50 μmol·L-1)共同孵育；ox-LDL(50 mg·L-1)、柚皮素(50 μmol·L-1)以及Nrf2抑制劑ML385(5 μmol·L-1)共同孵育。

1.3 小鼠處理ApoE-/-小鼠飼養于(20±2)℃、相對濕度40%-70%、自然晝夜采光環境中，將6周齡、體質量為(18-20)g的小鼠進行高脂肪飼料喂養(21%脂肪和0.15%膽固醇)，其中一部分進行80 mg·kg-1柚皮素喂養8周；另外一組在柚皮素誘導的過程中，通過腹腔注射ML385(10 mg·kg-1)，兩天一次，處理兩周。

1.4 Ⅱ相酶含量和活性檢測NQO-1含量的檢測通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒進行；GST和GCL活性檢測通過酶活性試劑盒進行。均按照南京建成生物工程研究所提供的操作步驟進行。以Biotek Epoch微孔板分光光度計(Biotech)測定相應指標的吸光度值。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)細胞或組織冰上裂解后，通過BCA 法進行蛋白定量。取等量蛋白于10% SDS-PAGE 蛋白電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉2 h后，相繼進行一抗、二抗孵育，最后將膜用TBST充分洗滌，并加入ECL發光液，在Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像分析系統(Bio-Rad)獲取圖像。

1.6 逆轉錄熒光實時定量PCR(RT-qPCR)獲取血管組織，用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA，取1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA第一條鏈，以此為模板進行PCR反應。用β-actin作為內參照，計算各目的基因相對于內參的表達量。

1.7 細胞免疫熒光取6-8 μm的主動脈根部冰凍切片，經丙酮固定后，進行0.2%Triton X-100(磷酸鹽緩沖液配制)通透處理。封閉之后，分別用鼠抗白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)和鼠抗單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)孵育過夜，再與熒光標記的二抗室溫孵育2 h，經洗滌、封片之后，在倒置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察、采集圖像。

1.8 免疫共沉淀將細胞接種于10 cm培養皿中，經各種相應的處理后進行裂解，并將預先洗好的蛋白A/G瓊脂糖珠子、抗Keap-1一抗加入到裂解液中，于4 ℃搖轉孵育2-3 h，進行免疫沉淀。混合物于4 ℃ 3 000 r·min-1離心3 min，棄上清，用1 mL 預冷的細胞裂解液洗滌3次，棄去上清。最后加入25-50 μL 2×SDS 上樣緩沖液重懸，沸水煮5 min，游離抗原、抗體和珠子。再于4 ℃、10 000 r·min-1離心1 min，收集上清，取20 μL樣品進行Western blot實驗。

2 結果

2.1 柚皮素激活Nrf2 活性對RAW264.7細胞分別進行ox-LDL處理、ox-LDL和不同濃度柚皮素共處理，結果發現ox-LDL促進核內Nrf2的水平，細胞質中的Nrf2含量并沒有明顯增加。而10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的柚皮素均可進一步提高核內Nrf2，其中50 μmol·L-1的柚皮素處理的細胞中的Nrf2水平比單獨ox-LDL處理的細胞的Nrf2水平提高了1.25倍(Fig 1A, B)。同時，免疫共沉淀結果顯示，柚皮素降低Nrf2與Keap1的結合(Fig 1C)。該結果說明，柚皮素促進其核內轉移，激活Nrf2。

2.2 柚皮素促進Ⅱ相解毒酶的表達分別對RAW264.7細胞進行處理：ox-LDL(50 mg·L-1)、ox-LDL+柚皮素(50 μmol·L-1)以及ox-LDL+柚皮素(50 μmol·L-1)+ ML385。對直接受控于Nrf2的Ⅱ相解毒酶NQO-1、GST、GCLc催化亞基(GCLc)以及GCL調節亞基(GCLm)的表達進行檢測，Western blot結果顯示與單獨的ox-LDL處理組相比，柚皮素(50 μmol·L-1)提高了上述解毒酶的蛋白水平(Fig 2)。另外，利用Nrf2抑制劑ML385對細胞進行處理后發現ML385均能明顯降低NQO1、GST、GCLc和GCLm的表達(Fig 2)，說明柚皮素可能通過Nrf2的作用，參與對Ⅱ相解毒酶的調節。

2.3 柚皮素抑制ox-LDL誘導的炎癥反應進一步分析柚皮素在細胞炎癥反應中的作用，結果顯示，ox-LDL明顯提高IL-6、MCP-1、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)蛋白水平，而柚皮素降低這些炎癥因子表達(Fig 3)；ML385處理破壞柚皮素的作用，促進炎癥因子IL-6、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的產生(Fig 3)，說明柚皮素的抑制炎癥作用與Nrf2的活化有關。

Fig 1 Nrf2 nuclear accumulation in RAW264.7 cells promoted by naringenin n=3)

2.4 柚皮素促進肝臟Ⅱ相解毒酶的活性對apoE小鼠進行高脂飲食(high fat diet, HFD)、HFD+柚皮素以及HFD+柚皮素+ML385處理后，發現HFD小鼠中肝臟的NQO-1、GST、GCLc以及GCLm的蛋白表達均明顯提高；柚皮素進一步促進這些Ⅱ相解毒酶的蛋白含量(Fig 4A)。而Nrf2抑制劑ML385則明顯降低小鼠肝臟NQO-1、GST、GCLc以及GCLm的水平(Fig 4A)。進一步我們通過ELISA對肝臟內NQO-1含量進行檢測，發現柚皮素提高了1.75倍(0.28 μg·g-1vs0.77 μg·g-1)；而ML385處理組與柚皮素組相比，降低了60%(0.31 μg·g-1vs0.77 μg·g-1)(Fig 4B)。同時，對GST、GCL兩種酶的活性進行檢測我們獲得相似的結果，即HFD和柚皮素均提高這兩種酶的活性，而ML385則對這些酶的活性有抑制作用(Fig 4C,D)。

Fig 2 The promoting effect of naringenin on phase Ⅱ detoxifying enzymes mediated by Nrf2 in RAW264.7 cells n=3)

2.5 柚皮素抑制血管炎癥對不同處理小鼠的主動脈血管炎癥進行分析，免疫熒光檢測結果顯示，柚皮素抑制HFD誘導的IL-6、MCP-1的表達，而ML385處理則消除這種抑制作用，使IL-6和MCP-1的表達上調(Fig 5A，B)。最后，我們利用RT-qPCR對血管炎癥介質的mRNA水平進行檢測，發現MCP-1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-18、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素(E-selectin)的表達均受柚皮素抑制，而且也被ML385所激活(Fig 5C)。該結果說明，柚皮素通過調節Nrf2的活性抑制體內主動脈血管的炎癥。

Fig 3 Protein levels of IL-6, MCP-1,VCAM-1 and ICAM-1 in RAW264.7 cells n=3)

Fig 4 Protein levels and activities of NQO-1, GST, GCLc and GCLm in livers

Fig 5 Vascular inflammation at aortic root in apoE-/- mice n=8)

3 討論

本研究證實柚皮素激活Nrf2介導的抗氧化以及Ⅱ相解毒反應，通過該調控作用抑制血管炎癥因子的產生。柚皮素之前已被證明在降低細胞毒性和氧化應激中具有重要的作用，研究發現柚皮素可抑制6-羥多巴胺誘導的線粒體損傷、防止神經退化Kesh；柚皮素對于各種殺蟲誘導的毒性均有較好的抑制作用[7]。另外，柚皮素還可以緩解CCl4、砷、鎘、鉛和鐵引起的細胞毒性[8-12]。而且人們發現柚皮素的解毒效果與其抑制氧化應激有關[13]。本研究中，我們進一步證實柚皮素還可以直接促進Ⅱ相反應，特別是提高NQO-1活性降低機體炎癥，參與細胞調控作用。NQO-1酶是一種典型的Ⅱ相酶，屬于黃素酶，可催化醌類物質從NAD(P)H接受雙電子，而被還原為活性更低的氫醌類化合物，從而參與醌及其衍生物的解毒反應。這為我們對柚皮素的藥理作用研究提供一個新的方向。

Ⅱ相解毒反應主要是藥物、激素以及其他外源性物質如食品添加劑等經過第一相反應，特別是在細胞色素P450氧化酶為主的氧化反應之后，再與極性分子如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽等的結合反應，降低活性、增強極性并順利排出體外。其中的Ⅱ相酶除了NQO-1外，我們還證明柚皮素可調控GCL、GST的活性。GCL包含GCL催化亞基(GCLc)和GCL調節亞基(GCLm)，是谷胱甘肽合成的限速酶。GST催化谷胱甘肽與底物結合，使其極性和水溶性增加。除此之外，在Ⅱ相酶中，還有UDP-葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、硫酸轉移酶(sulfotransferase，SULT)、N-乙酰轉移酶(N-acetyltransferase，NAT)等，分別負責轉葡萄糖醛酸、硫酸根和乙酰基的結合。本研究中，我們只對Nrf2關系比較密切的NQO1、GCL和GST進行分析，而柚皮素是否通過UGT、NAT和SULT等改善細胞生理狀況，還需要進一步研究。

Nrf2在機體的抗氧化還原反應中起中心位置。當機體活性氧如超氧陰離子自由基、過氧化氫以及羥自由基等增加，即產生氧化應激時，Nrf2被活化，進入核內促進具有ARE元件的基因轉錄。除了NQO-1和GSH-ST外，機體中抗氧化還原的因子如血紅素加氧酶 1(hemeoxygenase1，HO-1)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、硫氧還蛋白(thioredoxin)等均受Nrf2的調控[5]。本研究中，我們證實柚皮素可活化Nrf2，我們推測柚皮素還可能通過Nrf2調控這些氧化應激相關因子，即聯合抑制氧化應激和促進Ⅱ相解毒酶活性共同作用，抑制機體的炎癥反應。

在動脈粥樣硬化的發生過程中，過量的ox-LDL在血管壁的沉積是一個重要的事件，由此觸發血管炎癥和動脈粥樣硬化斑塊的形成。之前人們報道過柚皮素可以降低單核/巨噬細胞黏附，降低血脂、抑制機體抗炎，從而降低動脈粥樣硬化的發生[14-16]，本研究則從另外一個角度，即Nrf2介導的Ⅱ相解毒酶的活性調控上分析其抗炎作用和抗動脈粥樣硬化作用，將體內代謝調控與抗炎作用進一步聯系起來。

總之，本研究證實柚皮素上調Nrf2活性，促進下游與Ⅱ相解毒酶相關的分子如NQO-1、GCL和GST的表達，從而降低血管炎癥。這使我們對柚皮素的藥理作用有了進一步的認識，同時也促進人們對柚皮素的抗動脈粥樣硬化機制的了解。