1,2-二取代吡咯類化合物的體外抗衣原體活性研究

徐順鑫，解文霞，倪 敏，劉子義，柳凌艷，包小峰

(1.南通大學藥學院，江蘇 南通 226001；2.南開大學元素有機化學國家重點實驗室，天津 300071)

衣原體是革蘭陰性病原體，可導致性傳播疾病在內的多種人類疾病的高發。同時，它也與動脈粥樣硬化、中風和阿爾茨海默病等心腦血管疾病存在某種關聯[1-2]。衣原體具有獨特的雙相發育周期，可在具有感染能力的基體(elementray body，EB)和具有復制能力的網狀體(reticular body，RB)之間轉換[3-4]。阿奇霉素和多西環素是目前治療衣原體感染的首選藥物[5]，然而，癥狀復發和治療失敗的案例仍然很常見[6]，加上目前仍沒有可應用于臨床的人源疫苗[7]，這些現象都促使科研工作者試圖從天然或者合成的化合物中尋找新型抗衣原體藥物[8-16]。本文中，我們首次評估了前期合成的16個1,2-二取代吡咯類化合物的體外抗衣原體活性，并分析了它們作用機制，為抗衣原體藥物的研發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 1,2-二取代吡咯類化合物1,2-二取代吡咯類化合物1-16的合成和分離如先前所述[17]。化合物溶解在DMSO中保存，實驗時使用培養基稀釋到適當的濃度。為了消除可能存在的化合物聚集所產生的干擾作用，稀釋于培養基中的化合物樣品在室溫下以12 700 r·min-1(18 213×g)離心30 min，取上清評估其抗衣原體活性。

1.2 細胞培養和衣原體菌株HeLa S3和HEp-2細胞購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，并進行常規培養。沙眼衣原體L2(ChlamydiatrachomatisL2，434/Bu菌株，簡稱CtL2)和鼠衣原體(C.muridarum，Nigg II菌株，簡稱MoPn)在HeLa S3細胞中培養，肺炎衣原體(Chlamydiapneumonia，AR39菌株，簡稱CpnAR39)在HEp-2細胞中培養。EBs純化后，將其儲存在蔗糖-磷酸-谷氨酸緩沖液(SPG)中，于-80 ℃保存[16]。

1.3 試劑與儀器DMEM 培養基購自Hyclone公司；特級胎牛血清購自Sigma公司；Gentamycin購自上海生工生物；WST-1細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物；本實驗中使用的3種衣原體檢測一抗都是本課題組前期制備的常用抗血清[15-16]，其中小鼠抗MoPn多克隆抗血清檢測MoPn，因其能與CtL2發生交叉反應也用于檢測CtL2，小鼠抗CpnAR39多克隆抗血清檢測CpnAR39；FITC偶聯的小鼠二抗購自Sigma公司。

二氧化碳培養箱(美國Thermo Fisher公司)；多功能酶標儀(美國BioTek公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；DMI3000B熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 抗衣原體活性分析感染性子代滴度分析。將細胞接種到48孔板中，并按每孔感染復數(multiple of infection，MOI)0.2加入衣原體。除非另有說明，否則都在感染的同時將指定濃度的化合物添加到培養基中。使用0.5% DMSO為陰性對照，11.25 μmol·L-1四環素為陽性對照[16]。AR39感染后的細胞需在室溫下900×g離心1 h以促進其感染。在37 ℃(L2和MoPn)或35 ℃(AR39)培養36 h后，洗滌感染的細胞兩次，刮取細胞后通過超聲裂解釋放感染性子代EBs。將裂解液按1 ∶10連續稀釋后，再次感染96孔板中的細胞，感染36 h后(hours post infection，hpi)甲醇固定細胞，使用上述一抗和FITC偶聯的二抗進行染色，通過Leica DMI3000B熒光顯微鏡拍攝圖片，計數每個樣品中的包涵體數量，即為感染性子代EBs的數量。根據每組實驗3個復孔的EBs數量平均值，計算化合物處理組相對于DMSO陰性對照組的抑制百分率。以3次重復實驗的抑制百分率，非線性回歸計算出IC50值，并以平均值(95%置信區間)表示。

免疫熒光染色分析。將細胞接種到24孔板中的蓋玻片上，并如上所述加入衣原體感染細胞。36 h甲醇固定，并按上述順序進行抗體染色，檢測衣原體包涵體，同時利用Evans blue染色細胞質。Leica DMI3000B熒光顯微鏡采用10×目鏡和20×物鏡拍攝圖片。

1.5 細胞毒性測定使用WST-1細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒[14,18]評估1,2-二取代吡咯類化合物的細胞毒性。用含有8、16 μmol·L-1化合物或0.5% DMSO的培養基處理接種在96孔板中未感染的HeLa或HEp-2細胞。處理48 h后，添加10 μL WST-1試劑與細胞再培養2 h。根據細胞在450 nm處的吸光度，計算出化合物處理組相對于DMSO處理的對照組(設定為100%)的細胞活力。

1.6 EB感染能力測定將4×108IFU·L-1懸浮于SPG中的CtL2 EBs與不同濃度的化合物或0.5% DMSO在4 ℃共處理1 h。通過洗滌兩次除去殘留的化合物后，將EBs立即感染HeLa細胞。通過上述免疫熒光染色定量36 h時的包涵體數量。根據樣品中EBs數量，計算出化合物處理組相對于DMSO處理的對照組的百分抑制率。

1.7 后加藥實驗將MOI=0.2的CtL2感染過夜培養的HeLa細胞，并在0、2、12和24 h時給予8 μmol·L-1的化合物8處理。在36 h時，收集細胞并如上所述測定感染性子代EBs的產生。根據樣品中子代EBs數量，計算出化合物處理組相對于DMSO處理的陰性對照組的百分抑制率。

1.8 撤藥實驗將MOI=0.2的CtL2感染過夜培養的HeLa細胞，同時給予8 μmol·L-1的化合物8處理。在2、12、24和36 h，洗滌感染的細胞兩次除去殘留的化合物，并加入新鮮培養基。在36 h時，如上所述測定感染性子代EBs的產生以及百分抑制率數據。

2 結果

2.1 化合物對衣原體生長具有抑制作用按上述方法測定16個1,2-二取代吡咯類化合物不同濃度下對3株衣原體感染性子代滴度的影響，并根據抑制百分率數據分別計算出它們的IC50值，如Tab 1所示。整體來看，化合物對CtL2的抑制作用強于MoPn和CpnAR39，其中化合物8的抑制作用最強。通過給予8、16 μmol·L-1的化合物處理未感染的HeLa和HEp-2細胞來評估化合物的細胞毒性，如Tab 1所示。由于8 μmol·L-1的化合物8并沒有表現出可檢測出的細胞毒性，而且比其他化合物更有效，因此我們選擇它來進一步分析化合物的抗衣原體作用。

Tab 1 IC50 values(μmol·L-1)of compounds for Chlamydia

2.2 化合物8直接抑制衣原體的生長我們首先采用免疫熒光染色實驗，分析了化合物對CtL2的直接抑制作用。與對照組樣品相比，化合物8以劑量依賴性方式抑制了CtL2包涵體的形成(數量)和生長(大小)(Fig 1A)。包涵體的數量以及大小從1 μmol·L-1開始下降。在最高非細胞毒性濃度8 μmol·L-1時，包涵體很少且小。在16 μmol·L-1，幾乎看不見包涵體，類似于陽性對照組四環素的效果(終濃度11.25 μmol·L-1)[11]。此外，化合物對子代EBs產生的抑制作用與對包涵體數量和大小的抑制作用一致(Fig 1B)。

2.3 化合物8直接抑制衣原體的感染和增殖過程接下來，通過檢測化合物處理時間對其抑制作用的影響，進一步探索其抗衣原體作用。首先，我們檢測了在感染前對衣原體EBs的預處理是否會影響其感染能力。如Fig 2所示，用化合物8預處理EBs會導致包涵體的形成呈濃度依賴性減少，表明這些吡咯化合物直接降低了EBs的感染能力。

Fig 1 The inhibitory effect of compound 8 on Ct

Fig 2 Infectivity of EBs inhibited by compound

其次，我們檢測了在衣原體感染后不同時間將化合物加入(后處理，Fig 3A)或從已感染的培養物中撤去化合物(撤藥，Fig 3C)后，感染性子代產生的變化。結果發現，在12 h或更早加入8 μmol·L-1的化合物不會改變其抗衣原體效果。在24 h加入化合物時，其抑制活性降低至約60%(Fig 3B)。如果在2 h從已感染的培養物中撤去化合物8，其對感染性子代的抑制率降低至75%。當化合物在12 h撤去時，其抑制效果略微降低至約95%。如果化合物在24 h撤去，仍然能保持其抑制作用。這些結果說明化合物還通過靶向衣原體生命周期24 h之前的早期至中期階段來抑制衣原體的生長。

Fig 3 Impact of compound 8 administration time on antichlamydial efficacy

3 討論

衣原體是世界性的人類致病菌。雖然它們對幾種廣譜抗生素敏感，但臨床治療失敗的情況時有發生。這使得人們對于新型抗衣原體藥物的需求越來越強烈[8-16]。在本研究中[13]，我們首次發現合成的1,2-二取代吡咯類化合物能夠抑制衣原體感染。對感染性子代EBs的IC50值顯示，大多數化合物在微摩爾范圍內均能抑制衣原體生長，這與我們之前合成的1,2,3,5-四取代吡咯化合物類似。與MoPn和CpnAR39相比，這些1,2-二取代吡咯類化合物選擇性抑制CtL2。吡咯的C-1和C-2被對甲基苯基取代的化合物8具有最強的抗衣原體活性。與化合物5、15、16相比，除去R1、R2的苯基取代基上的甲基后，其抗衣原體活性降低，表明了甲基的重要性。R1和R2上具有苯基取代基的化合物16抗衣原體活性最差，表明了苯基上的取代基對其抗衣原體活性的重要性。

WST-1數據顯示，在本研究的抗衣原體活性測定中使用的最高濃度16 μmol/L，除了化合物9和13，大多數化合物對宿主細胞均具有明顯的毒性作用。此外，在8 μmol·L-1時，化合物8和14也沒有顯示出細胞毒性。與1,2,3,5-四取代吡咯化合物相比，1,2-二取代吡咯類化合物的細胞毒性隨著取代基團的增加而降低[13]。所有被鹵代苯基取代的化合物均顯示出弱的細胞毒性。C-1具有甲氧基苯基和C-2具有苯基的化合物1對宿主細胞毒性最強。

衣原體獨特的EB/RB雙相生命周期為治療干預提供了多種可能。本研究中，EB預處理實驗顯示化合物8以濃度依賴性方式減少了衣原體包涵體的形成，這表明1,2-二取代吡咯可通過在衣原體進入宿主細胞前的早期階段抑制EB的感染能力來阻斷衣原體感染。由于在最高濃度8 μmol·L-1化合物8也僅能抑制40%左右的衣原體感染(Fig 2)，這說明化合物還靶向其他階段來抑制衣原體的生長。后加藥實驗和撤藥實驗進一步證明了化合物8還通過靶向衣原體生命周期24 h之前的早期至中期來干擾衣原體的生長過程(Fig 3)。

我們的體外研究數據表明，1,2-二取代吡咯類化合物是一類具有抗衣原體活性的化合物。其中，C-1和C-2位置具有對甲基苯基的化合物8抑制活性最強。由鹵代苯基、苯基和萘基取代的化合物的抗衣原體活性均較弱，表明吡咯上取代基的重要性。這些化合物通過在早期降低EB感染能力對衣原體的感染過程產生抑制作用，并靶向發育周期的早期到中期來干擾衣原體的生長過程。本研究表明，1,2-二取代吡咯類化合物可作為抗衣原體藥物開發的先導化合物。