吉西他濱增強HUVEC疫苗抗胰腺癌作用實驗研究

周 玲，楊 晨，高 艷，趙曉雨，徐茂磊

(1.濱州醫學院藥學院，山東 煙臺 264003；2.山東國際生物科技園發展有限公司，山東 煙臺 264670)

胰腺癌是消化道腫瘤中惡性程度極高的一種，其解剖位置的特殊性導致早期癥狀不明顯、病情惡變快、預后極差，且在癌癥早期就發生轉移，80%的胰腺癌患者確診時已失去手術切除的時機，所以胰腺癌的非手術治療在延長胰腺癌患者生命、改善患者預后方面起著重要作用[1-2]。內科藥物治療是胰腺癌患者主要的非手術治療手段，包括化療和靶向治療。然而，化療藥物毒副作用大，而現有的分子靶向藥物如吉非替尼、厄洛替尼等很容易產生耐藥，因此臨床上亟需探索新的胰腺癌治療藥物。

隨著腫瘤免疫學的發展及對腫瘤發生發展機理的不斷深入認識，腫瘤疫苗已成為腫瘤免疫治療的研究熱點之一。腫瘤疫苗即利用腫瘤抗原，通過調節機體的免疫應答反應以抑止腫瘤的發生、發展，從而實現腫瘤治療的目的[3]。我們前期對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)疫苗進行了持續研究，證實HUVEC疫苗可以誘發特異性的靶向腫瘤新生血管的免疫應答，通過阻斷血管新生可以產生良好的抗腫瘤效應。但跟其它抗原形式的腫瘤疫苗面臨類似的問題，即HUVEC疫苗雖然在預防性免疫中顯示了良好的抗腫瘤作用，但其在治療性免疫中的抗腫瘤作用仍有待提升[4-7]。

吉西他濱(gemcitabine，GEM)是一種脫氧嘧啶類似物，可通過抑制細胞DNA的合成以發揮抗腫瘤作用，已廣泛應用于胰腺癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的臨床治療[8]。研究證實低劑量GEM可以降低細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK細胞)培養體系中CD4+CD25+調節性T細胞的比例，提高CIK細胞的抗腫瘤效應[9]。含有GEM的胰腺癌細胞培養基能有效刺激樹突狀細胞成熟，誘導T細胞增殖，誘發細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)抗腫瘤免疫應答[10]，這都提示我們小劑量GEM可以提升疫苗誘導的抗腫瘤免疫應答。在本實驗中，我們將小劑量GEM引入HUVEC疫苗方案，以Pan02胰腺癌作為研究對象，考察小劑量GEM能否提升HUVEC疫苗在治療性免疫中的抗胰腺癌作用，并研究可能的機制，為優化HUVEC疫苗臨床治療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物和細胞株 ♂ C57BL/6小鼠，4-5周齡，購自濟南朋悅實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(魯)20190003，SPF級條件下飼養，符合濱州醫學院倫理委員會認可；Pan02小鼠胰腺癌細胞購自中科院上海細胞庫，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，置于5% CO2培養箱于37 ℃條件下培養。HUVEC細胞購自美國ATCC細胞庫，使用ECM內皮細胞專用培養基，置于5% CO2培養箱于37 ℃條件下培養。

1.1.2試劑 注射用鹽酸吉西他濱購自江蘇南京正大天晴制藥有限公司(批準文號：國藥準字H20093403)；RPMI-1640培養基(貨號：SH30809.01)、胰酶消化液(貨號:SH30042.01)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(貨號：11011-8611)購自杭州四季青試劑有限公司；細胞培養用青/鏈霉素混合液(貨號：P1400)、TMB單組分顯色液(貨號：PR1200)，購自北京索萊寶科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA，貨號：C7642)購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗小鼠IgG抗體(貨號：ZB2305)購自北京中杉金橋生物科技有限公司；CytoTox96非放射性細胞毒性檢測試劑盒(貨號：G1780)購自美國Promega公司；小鼠IFN-γ檢測試劑盒(貨號：SEA049Ra)購自武漢云克隆科技股份有限公司；其它試劑均為市售。

1.2 實驗方法

1.2.1荷瘤小鼠模型的建立及分組 將C57BL/6小鼠隨機分為4組：PBS對照組，GEM組，HUVEC疫苗組和GEM與HUVEC疫苗聯合(HUVEC-GEM)組。收集對數生長期的Pan02小鼠胰腺癌細胞，調整細胞濃度為5×109個·L-1，于小鼠左肋皮下接種0.1 mL(接種量為5×105細胞/小鼠)。在接種后的d 2、8、14皮下注射0.1 mL HUVEC疫苗(含1×106HUVEC)，吉西他濱組于腫瘤接種后d 1、7、13腹腔注射100 μL GEM，使用劑量為30 mg·kg-1，HUVEC-GEM組腹腔注射100 μL GEM并且皮下注射100 μL的HUVEC疫苗，陰性對照組皮下注射100 μL PBS。待腫瘤成瘤后隔天用游標卡尺測量腫瘤長徑和寬徑，腫瘤體積按V=0.52×長徑×寬徑2計算，接種腫瘤后的d 18處死所有小鼠，剝取腫瘤并稱重，計算抑瘤率，抑瘤率/%=(1-實驗組平均瘤質量/對照組平均瘤質量)×100%，并將剖取的腫瘤組織切片，HE染色后作病理分析。各組小鼠處死前眼眥靜脈叢取血分離血清，-80 ℃保存備用。在實驗過程中，觀察小鼠的日常行為活動、毛發以及飲食情況等，并每周稱量小鼠體質量，以評估小鼠整體健康狀況。

1.2.2免疫血清中HUVEC抗體檢測 用反復凍融的HUVEC裂解物作為包被抗原，將其溶解在pH 9.6碳酸鹽緩沖液中，以100 μL/孔加入96孔酶標板，置于4 ℃冰箱中過夜。使用PBST洗滌3次，每孔加入100 μL 1 ∶50倍稀釋的免疫血清，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3次，每孔加入1 ∶10 000倍稀釋的HRP標記的兔抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，使用TMB顯色液室溫避光顯色20 min，用4 mol·L-1硫酸終止反應，酶標儀讀取450 nm波長下吸光度值。

1.2.3淋巴細胞增殖實驗 按治療性免疫程序免疫小鼠，第三次免疫結束后7 d，脫頸處死各組小鼠，無菌分離小鼠脾臟，研磨過200目篩網，PBS洗滌重懸，加入等量的紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心取沉淀，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸細胞，調整細胞濃度為1×1010·L-1，于96孔細胞培養板接種，每孔接種100 μL(1×105細胞)，每組脾細胞中分別加入空白1640培養基、5 mg·L-1ConA、100 mg·L-1的HUVEC裂解物，每個樣品設置4個復孔。于37 ℃ CO2培養箱中培養48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，避光孵育1-2 h，酶標儀讀取450 nm波長下吸光度值。

1.2.4CTL殺傷活性實驗 脾淋巴細胞懸液制備同1.2.3部分，使用美國Promega公司CytoTox96非放射性細胞毒性檢測試劑盒檢測CTL細胞殺傷活性。各組小鼠脾淋巴細胞經HUVEC裂解物刺激2 d后作為效應細胞使用，取對數生長期的HUVEC細胞和Pan02細胞作為靶細胞。按照200 ∶1，100 ∶1，50 ∶1，25 ∶1的效靶比將脾淋巴細胞和HUVEC或Pan02細胞共培養于96孔U型細胞培養板中，并設置相應的效應細胞和靶細胞對照組，37 ℃共孵育4 h，吸取50 μL培養上清至96孔平底細胞培養板中，加入50 μL檢測試劑，室溫避光孵育30 min，每孔加入50 μL終止液，酶標儀讀取490 nm波長下吸光度值，釋放率按下列公式計算：釋放率/%=(實驗組OD490-效應細胞自發OD490-靶細胞自發OD490)/(靶細胞最大OD490-靶細胞自發OD490)×100%。

1.2.5小鼠血清中IFN-γ檢測 按治療性免疫程序免疫小鼠，第三次免疫結束后7 d，眼眥靜脈叢取血分離各組血清，按照小鼠IFN-γ ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中IFN-γ水平。

2 結果

2.1 GEM增強HUVEC疫苗抗胰腺癌作用如Fig 1所示，PBS組小鼠腫瘤生長迅速，腫瘤生長曲線較陡直，HUVEC、GEM及HUVEC-GEM治療均在一定程度上延緩了腫瘤生長，其中HUVEC-GEM治療抑制腫瘤生長的作用最顯著。接種Pan02胰腺癌細胞18 d后PBS組腫瘤體積達到(1321.12±398.12)mm3，GEM、HUVEC和GEM+HUVEC組腫瘤體積分別為(1 058.52±327.08)mm3、(892.19±287.52)mm3及(575.33±128.37)mm3。實驗結束后剖取的腫瘤瘤重結果與腫瘤體積結果一致，HUVEC-GEM組平均瘤質量明顯低于HUVEC組及GEM單藥組(P<0.05vsHUVEC,P<0.01vsGEM)，各組瘤質量分別為PBS:(1.01±0.11)g，GEM:(0.84±0.12)g，HUVEC:(0.65±0.17)g，HUVEC-GEM:(0.44±0.10)g。以上實驗結果顯示GEM的引入增強了HUVEC疫苗的抗腫瘤生長作用。

2.2 GEM增強HUVEC疫苗誘導的腫瘤細胞壞死為進一步研究GEM增強HUVEC疫苗的抗胰腺癌藥效學，我們對剖取的腫瘤進行切片后HE染色分析，光學顯微鏡下觀察染色切片。實驗結果如Fig 2所示，PBS組腫瘤細胞生長活躍，細胞結構較完整，未發現明顯的壞死及炎癥細胞浸潤。GEM、HUVEC及HUVEC-GEM組均出現了一定程度的細胞壞死，伴隨核固縮或溶解，其中HUVEC-GEM組腫瘤細胞壞死情況最明顯，可見較大面積細胞壞死(壞死區域如箭頭所示)，這說明GEM增強了HUVEC疫苗誘導的腫瘤細胞壞死。

2.3 GEM增強HUVEC疫苗誘導的抗體水平采用ELISA檢測各組治療方案誘導產生的抗體水平，實驗結果如Fig 3所示，HUVEC及HUVEC-GEM組小鼠免疫血清中抗體水平有一定程度的上升，而GEM組未有HUVEC抗體產生。與HUVEC組比較，HUVEC-GEM組抗體水平也有上升(P<0.01)，這說明低劑量的GEM引入HUVEC疫苗后，不會對小鼠免疫系統產生抑制，反而在一定程度上會提升HUVEC疫苗誘導的體液免疫應答水平。

Fig 1 Therapeutic antitumor effect induced by GEM and HUVEC vaccine in subcutaneous pancreatic cancer-bearing mice n=3)

Fig 2 Histopathology study of tumor tissues (200×)

Fig 3 Detection of anti-HUVEC humoral immune responses

2.4 GEM增強HUVEC疫苗誘導的淋巴細胞增殖活性采用淋巴細胞增殖實驗檢測各組治療方案誘導的細胞免疫應答強度，如Fig 4所示，PBS對照組與GEM組淋巴細胞未顯示明顯的增殖活性，而HUVEC和HUVEC-GEM組淋巴細胞均顯示了一定的增殖活性，其中HUVEC-GEM給藥組淋巴細胞增殖活性最明顯，與HUVEC組差異有統計學意義(P<0.01)，這說明低劑量GEM可以增強HUVEC疫苗誘導的淋巴細胞增殖活性。

2.5 GEM增強HUVEC疫苗誘導的CTL細胞殺傷活性我們進一步使用美國Promega公司CytoTox96細胞毒性檢測試劑盒檢測各組治療方案誘導的CTL細胞殺傷活性。如Fig 5所示，隨著E ∶T比值的增大，HUVEC及HUVEC-GEM組效應細胞對靶細胞的殺傷活性逐漸增高，其中HUVEC-GEM組殺傷活性最高(P<0.05vsHUVEC)。HUVEC-GEM組小鼠脾細胞在E ∶T為50 ∶1、100 ∶1及200 ∶1時均高于HUVEC組，而PBS和GEM組小鼠脾淋巴細胞對HUVEC細胞無殺傷功能。當靶細胞為Pan02細胞時，所有組淋巴細胞未顯示殺傷活性，這說明疫苗誘導的CTL殺傷活性是HUVEC特異的。

Fig 4 Effect of different treatment on lymphocyte proliferation n=4)

Fig 5 Level of CTLs induced by different treatment n=4)

2.6 GEM增強HUVEC疫苗誘導的免疫血清IFN-γ含量采用ELISA檢測試劑盒檢測各組小鼠免疫血清中IFN-γ含量，實驗結果如Fig 6所示，HUVEC組[(158.33±9.51)ng·L-1]和HUVEC-GEM組[(225.32±11.99)ng·L-1]IFN-γ含量都有所升高，GEM單藥組免疫血清中未檢測到IFN-γ；此外，HUVEC-GEM治療后小鼠免疫血清中IFN-γ含量也遠高于HUVEC組，差異有統計學意義(P<0.01)，以上結果均表明低劑量GEM可以增強HUVEC疫苗誘導的細胞免疫應答強度。

Fig 6 Detection of INF-γ content of immune sera n=3)

3 討論

隨著醫學免疫學等學科的迅猛發展及對腫瘤微環境的不斷認識，腫瘤免疫治療得到了更深入系統的研究。本論文所研究的HUVEC疫苗是一種靶向腫瘤新生血管的主動免疫治療策略，可以依靠有限次數的治療誘導機體產生持續的免疫反應，抑制腫瘤血管的生成，拮抗腫瘤細胞的生長和轉移，能夠克服單克隆抗體等傳統血管生成抑制劑類藥物用藥頻繁，毒副作用大，患者用藥負擔重的缺點[11]。在我們前期研究中發現HUVEC疫苗在預防性免疫中抗腫瘤作用明顯，但該疫苗在治療性免疫中的抗腫瘤藥效并不能完全令人滿意，故而提升HUVEC疫苗的治療性抗腫瘤藥效是疫苗研發中的重要問題。

腫瘤抗原特異性CTL細胞是起主要殺傷作用的效應細胞，如何誘導機體產生有效的CTL免疫應答反應是腫瘤疫苗研發中的關鍵技術。自上世紀80年代研究人員發現低劑量環磷酰胺不僅不會產生免疫制劑作用，反而可以增加抗腫瘤免疫反應以來，化療藥的免疫激活作用引起了研究人員的興趣。大量研究已證實持續節拍性非治療劑量化療藥能發揮免疫調節作用，可以協助腫瘤疫苗誘導更有效的CTL免疫應答，提升疫苗的抗腫瘤藥效[12-14]。本論文中所考察的化療藥物GEM是胰腺癌一線化療藥物，臨床上已應用多年，安全性有保障。本研究中，我們將其引入HUVEC疫苗，考察非治療劑量的GEM能否提升HUVEC疫苗在治療性免疫中的抗腫瘤作用，并以此為例探討非治療劑量化療藥增強HUVEC疫苗抗腫瘤作用的可能機制。

實驗結果表明，低劑量GEM引入HUVEC疫苗免疫方案后，可以有效提升HUVEC疫苗的治療性抗胰腺癌作用，HUVEC-GEM組在治療性免疫中的抑瘤率可以達到56.44%；GEM的引入可以協助HUVEC疫苗有效改善荷瘤小鼠的腫瘤微環境，腫瘤組織HE染色結果證實HUVEC-GEM組出現了更多的腫瘤細胞壞死及炎性細胞浸潤；GEM引入后，協助HUVEC疫苗更有效的激活了B淋巴細胞，在經過2、8及14 d 3次免疫后，HUVEC-GEM組小鼠免疫血清中產生了高水平的HUVEC-抗體；HUVEC-GEM組小鼠的T細胞應答水平也明顯高于其它各治療組，說明GEM也增強了HUVEC疫苗激活腫瘤抗原特異性T細胞反應的能力，提升了HUVEC疫苗的特異性CTL殺傷活性；給藥過程中觀察各組小鼠證實HUVEC-GEM治療方案的毒副作用較單一給藥組并沒有明顯增加，實驗小鼠的耐受性良好。綜上所述，本實驗的結果證實低劑量GEM作為免疫佐劑能增強HUVEC疫苗誘導的免疫應答強度，提升HUVEC疫苗在治療性免疫中的抗腫瘤藥效，本研究為HUVEC疫苗臨床治療方案提供了新選擇，有潛在巨大的臨床應用價值。