蘆可替尼和地西他濱協(xié)同抑制TET2敲降的HEL細(xì)胞生長作用

付莉霞，王穎韶，肖方楠，宋濬哲，白姣姣，周 圓，白 潔

[1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211；2.中國醫(yī)學(xué)科院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020]

經(jīng)典的費(fèi)城染色體陰性骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)是一組造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，主要包括真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)。MPN可進(jìn)展為骨髓纖維化(myelofibrosis，MF)，甚至轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[1]。2005年，多個課題組發(fā)現(xiàn)MPN的造血細(xì)胞中存在JAK2V617F突變，在其發(fā)病機(jī)制和靶向治療研究中有重要意義[2-3]。該突變導(dǎo)致JAK-STAT級聯(lián)信號通路過度激活，從而引起紅細(xì)胞、血小板或粒細(xì)胞的過度增殖[4]。

TET2屬于α-草酸戊二酸依賴酶的家族，催化5-甲基胞嘧啶(5-mc)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基-胞嘧啶(5-hmc)，通過改變基因的甲基化狀態(tài)并在表觀遺傳水平調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，該突變是MPN發(fā)展過程最常見的突變之一[5]。Moran-Crusio等[6-7]通過小鼠模型研究證實(shí)了JAK2V617F伴TET2缺失可以促進(jìn)髓系細(xì)胞增生，從而加速M(fèi)PN的進(jìn)程。此外，Iurlo等[8-9]通過分析MPN病人的基因突變與其預(yù)后的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)TET2突變的存在會增加PV患者向AML轉(zhuǎn)化的風(fēng)險。

進(jìn)展為AML的MPN患者生存極差，且常規(guī)的化療藥物緩解率低，患者耐受性差。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱和阿扎胞苷是加速/急性期MPN(accelerated or blast phase disease MPN，MPN-AP/BP)的主要治療藥物。其中，地西他濱除誘導(dǎo)G2/M期的細(xì)胞阻滯外，還可通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來影響DNA的轉(zhuǎn)錄來殺傷腫瘤細(xì)胞。研究報道，伴有TET2突變的MDS/AML去甲基化治療有效率較高。但地西他濱對TET2和JAK2V617F共突變腫瘤細(xì)胞的有效性，及蘆可替尼是否協(xié)同地西他濱殺傷TET2和JAK2V617F共突變腫瘤細(xì)胞尚未明確。本文在攜帶JAK2V617F的HEL細(xì)胞中建立了TET2敲降模型，對地西他濱和蘆可替尼的敏感性及其協(xié)同作用進(jìn)行評價，為TET2和JAK2V617F共突變的MPN患者提供臨床治療的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑及儀器地西他濱購自MCE(批號17685)；蘆可替尼為諾華公司惠贈；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(批號8119392)、RPMI 1640(批號8120354)和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(批號04-001-1)均購自BI；CCK-8試劑盒(批號04-001-1)購自日本Dojindo Laboratories; TRIzol(批號279511)購自Invitrogen; ImpromⅡ反轉(zhuǎn)試劑盒(批號0000134688)購自Promega; Real-time DNA聚合酶mixture(批號)(FastStart Univeral SYBR Green Master)購自Roche(批號46660900)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根(批號U8915)；流式細(xì)胞儀Canto II購自美國Becton Dickinson公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S購自日本Nikon 司；高速離心機(jī)(型號Avavti J-26 XP)購自美國Beckman Coulter公司；ImageQuant LAS 4000發(fā)光成像儀購自GE。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件293T細(xì)胞株，HEL細(xì)胞株均購自ATCC細(xì)胞庫，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)細(xì)胞庫保管。293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+10%FBS培養(yǎng)基中，HEL細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于RPMI 1640+10% FBS中，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d離心換液，293T細(xì)胞在 70%-90%融合后經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后傳代。

1.3 慢病毒包裝及病毒滴度測定TET2和PIGPZ shRNA購自Dharmacon(GE Healthcare Dharmaco，美國)。shRNA的靶向序列是TATGAGTCTCGAAC TCGCT，靶向人TET2基因編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)2383-2401位點(diǎn)，位于外顯子3(NCBI序列號：NM_001127208.3)。包裝載體psPAX2、pCMV-VSV-G由英國帝國理工學(xué)院Ernesto Yague博士惠贈。載體骨架結(jié)構(gòu)為Fig 1A，通過已建立的方法進(jìn)行病毒包裝和滴度測定[10]。

1.4 慢病毒感染HEL細(xì)胞取對數(shù)生長的HEL細(xì)胞加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1×105/孔)。根據(jù)MOI值5-10計(jì)算加入病毒體積(感染細(xì)胞數(shù)×被感染細(xì)胞MOI值/濃縮后慢病毒滴度)，最后用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液定容至500 μL/孔。1 800 r·min-1，33 ℃，離心90 min，6 h后換液。d 2用相同方法做二次感染。感染48 h后，流式細(xì)胞儀分選GFP+細(xì)胞用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA提取及Real-time PCR取對數(shù)生長期的EV HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞2×106，TRIzol法提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行Real-time PCR，引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[11]，反應(yīng)體系為(10 μL)：SYBR Green Master 5 μL，上下游引物各0.5 μL，Template cDNA 0.5 μL，ddH2O(RNase-free)4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min 1個循環(huán)，95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s共40-45個循環(huán)。根據(jù)2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.6 細(xì)胞增殖檢測取對數(shù)生長期的EV HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞，用含有10% FBS的RPMI 1640調(diào)整濃度為8×107·L-1，接種于96孔板中，每孔90 μL，EV-HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞各3個復(fù)孔。培養(yǎng)后每孔加入CCK-8 10 μL，37 ℃孵育4 h，輕輕震蕩混勻。酶標(biāo)儀檢測450 nm光密度(OD)值，檢測d 0、1、2、3、4、5和6細(xì)胞增殖情況。

1.7 72 h藥物半數(shù)致死劑量(IC50)測定采用CCK-8測定細(xì)胞對蘆可替尼和地西他濱等化療藥物的敏感性。取對數(shù)生長期的EV-HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞，用含有10%FBS的RPMI 1640調(diào)整濃度為8×107·L-1，接種于96孔板中，每孔90 μL，分組加藥，每個濃度設(shè)3個平行孔，處理組加不同濃度的藥物，陰性對照組加等體積的藥物溶劑，培養(yǎng)72 h后每孔加入CCK-8 10 μL，37 ℃孵育4 h，輕輕震蕩混勻。酶標(biāo)儀檢測450 nm光密度(OD)值。按以下公式計(jì)算藥物對細(xì)胞的生長抑制率。抑制率=(對照組OD值-處理組OD值)/對照組OD值[12]。

1.8 藥物協(xié)同指數(shù)測定參考單藥時的IC50值，蘆可替尼選擇0.5、1和2 μmol·L-1。地西他濱選擇3.2、16 和80 nmol·L-1，進(jìn)行單藥抑制作用測定和各個濃度兩兩混合的抑制作用測定。參照測定藥物IC50時的細(xì)胞濃度和鋪板方式進(jìn)行試驗(yàn)，每種濃度組合3個平行孔，設(shè)計(jì)3×3矩陣。加藥處理72 h后，通過CCK-8檢測細(xì)胞活性。分別計(jì)算每個濃度組合下對細(xì)胞的抑制率，CalcuSyn軟件計(jì)算各個濃度組合下的藥物CI值。CI值<1.0代表兩種藥物在該濃度組合下具有協(xié)同效應(yīng)，CI值>1.0代表兩種藥物在該濃度組合下具有拮抗效應(yīng)[13]。

1.9 細(xì)胞系克隆形成(colony formation cells, CFC)實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的EV-HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞，用含有10%FBS的1640調(diào)整濃度為8×107·L-1后接種于24孔板中，每孔1 mL，根據(jù)72 h的IC50值分別用2 μmol·L-1的蘆可替尼和30 nmol·L-1地西他濱分別處理EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#24 h后，再次計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107·L-1，分別取30 μL加入到1.2 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)基H4230，補(bǔ)充300 μL RPMI 1640培養(yǎng)基使各處理組體積相同，渦旋混勻，4 ℃冰箱靜置10 min至氣泡升至液面上部。用1 mL注射器(20 mL的槍尖)將混勻的細(xì)胞加入24孔板中，每孔0.4 mL(約200個細(xì)胞)，每個處理組3個重復(fù)孔。于37 ℃，5% CO2，濕度>95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用無菌的PBS填充其余的孔以防半固體培養(yǎng)基干燥，14 d后計(jì)數(shù)不同的大小集落形成單位。

2 結(jié)果

2.1 建立TET2敲降的HEL細(xì)胞系HEL細(xì)胞是攜帶JAK2V617F人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞系，常用作MPN研究。為了探究蘆可替尼和地西他濱對JAK2V617F和TET2雙突變細(xì)胞的影響，我們在體外利用shRNA在HEL細(xì)胞中敲降TET2(TET2-KD HEL)。首先，我們將TET2 shRNA和空載質(zhì)粒進(jìn)行了慢病毒包裝，并分別感染HEL細(xì)胞。EV HEL作為對照組，TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#作為實(shí)驗(yàn)組。接著我們通過流式細(xì)胞術(shù)評價感染效率，EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#感染效率分別為97.8%、88.4%和88%(Fig 1B)。因此我們進(jìn)行了流式分選并在分選后再次通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行陽性率評估，EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#陽性率分別為99.6%、100%和99.9%(Fig 1C)。接下來，我們利用Real-time PCR對TET2敲降效率進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)敲降組TET2的表達(dá)下降了35%-40%(Fig 1D)。提示成功建立EV HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞系。

2.2TET2敲降后HEL細(xì)胞增殖能力增加有小鼠模型研究表明，在JAK2V617F和TET2敲降的雙突變小鼠中髓系細(xì)胞細(xì)胞增殖能力增加[14]。為了研究TET2敲除對HEL細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們通過CCK-8方法檢測EV HEL和TET2-KD HEL細(xì)胞的增殖情況，通過檢測d 0到d 6細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)與EV HEL相比，TET2-KD HEL增殖能力明顯增加(Fig 2，P<0.05)。

Fig 1 The positive rate and knockdown efficiency of HEL cells after lentivirus transfection

Fig 2 Proliferation of EV HEL, TET2-KD HEL1# and TET2-KD HEL2#

2.3TET2敲降后HEL細(xì)胞藥物敏感性測定為了探索蘆可替尼和地西他濱對TET2-KD HEL的抑制作用，我們通過藥物處理72 h后的 IC50評價其對蘆可替尼和地西他濱的敏感性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蘆可替尼在EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#中IC50(72 h)差異無顯著性，分別為(1.653±0.27)、(1.979±0.398)和(1.814±0.328 1)μmol·L-1(Fig 3A和3C，n=3)。但是，相較于EV-HEL而言，TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#對地西他濱的敏感性下降，其IC50(72 h)分別為(0.03±0.005)、(0.067±0.014)和(0.058±0.008)μmol·L-1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3B和3C，n=3，P<0.05)。接下來，我們分別用2 μmol·L-1蘆可替尼和30 nmol·L-1地西他濱處理EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#，并進(jìn)行半固體克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#在蘆可替尼和地西他濱單藥處理后耐藥克隆數(shù)均高于EV-HEL，且其中大克隆的數(shù)目明顯增加(Fig 3D，n=3，P<0.05)。以上結(jié)果提示，雖然72 h藥物敏感試驗(yàn)中TET2-KD HEL仍然對蘆可替尼敏感，但是卻對地西他濱存在耐藥現(xiàn)象，且隨著時間的增加，TET2-KD HEL對蘆可替尼和地西他濱的藥物敏感性均顯著下降。

Fig 3 IC50 and drug-resistant colony numbers of ruxolitinib and dectabine on EV-HEL, TET2-KD HEL1# and TET2-KD HEL2# cells

Fig 4 Combination index of ruxolitinib and decitabine

2.4 蘆可替尼和地西他濱在TET2敲降HEL細(xì)胞中有協(xié)同抑制作用臨床研究證實(shí)，在MPN-AP/BP患者聯(lián)合蘆可替尼和地西他濱，MPN-AP/BP耐受性較好[15]。考慮到TET2-KD HEL對地西他濱耐藥，因此，我們在EV HEL和TET2-KD HEL中聯(lián)合應(yīng)用蘆可替尼和地西他濱，觀察其是否有協(xié)同作用。結(jié)果顯示，與單獨(dú)用藥相比，這兩種藥物的組合對于EV-HEL細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，但在TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#細(xì)胞中，通過計(jì)算其抑制率并通過CalcuSyn軟件分析其協(xié)同指數(shù)CI值，發(fā)現(xiàn)其在多個濃度組合下有明顯協(xié)同效應(yīng)，且蘆可替尼1 μmol·L-1和地西他濱80 nmol·L-1聯(lián)合用藥對TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#抑制率分別可達(dá)到80%和82%。以上研究結(jié)果提示，對于TET2和JAK2V617F雙突變的MPN患者而言，蘆可替尼聯(lián)合地西他濱可能是一種行之有效的用藥方案。

3 討論

JAK2V617F突變是MPN患者最常見的驅(qū)動型突變之一，該突變的發(fā)現(xiàn)在MPN患者機(jī)制研究和靶向治療過程有里程碑意義，研究發(fā)現(xiàn)90%以上的PV患者有JAK2V617F突變，在ET和PMF患者中其突變頻率也可達(dá)50%以上，該突變導(dǎo)致JAK激酶對細(xì)胞因子高度敏感或不依賴細(xì)胞因子仍能持續(xù)活化，從而激活下游的STAT3/5或PI3K/AKT等通路，促進(jìn)造血細(xì)胞的過度增殖，并導(dǎo)致MPN的發(fā)生。研究表明，PV、ET和PMF10年內(nèi)進(jìn)展為AML的比率分別為2.3%-14.4%、0.7%-3%和10%-20%[16]。JAK1/2抑制劑蘆可替尼可以明顯改善MPN患者的體質(zhì)性癥狀，縮小脾臟體積，并延緩脾大的發(fā)生，但蘆可替尼單藥治療MPN-AP/BP患者還沒有相關(guān)報導(dǎo)。

隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)MPN患者中除了常見的JAK2V617F、CALR和MPL突變外，許多其它與表型和預(yù)后密切相關(guān)的基因突變也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中包括TET2、ASXL1和DNMT3A等表觀遺傳學(xué)突變，TET2是其最常見的伴隨突變之一。小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TET2缺失的JAK2V617F突變小鼠表現(xiàn)為白細(xì)胞的增多、脾腫大、髓外造血及生存期縮短，且疾病進(jìn)展迅速。而通過分析MPN病人的分子學(xué)突變與疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸相關(guān)性，也發(fā)現(xiàn)TET2突變不僅參與MPN疾病的發(fā)生，還與疾病的進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，針對多種信號通路的聯(lián)合用藥可能會為改善MPN-AP/BP患者治療現(xiàn)狀、提高治療效果提供可行的方案。

考慮到表觀遺傳學(xué)突變在MPN的發(fā)生與疾病進(jìn)展中其重要作用，因此目前在MPN-AP/BP患者中使用蘆可替尼聯(lián)合表觀遺傳學(xué)相關(guān)的小分子藥物也是臨床研究的熱點(diǎn)之一。DNA的去甲基化藥物阿扎胞苷和地西他濱都可以調(diào)節(jié)DNA的去甲基化而影響其轉(zhuǎn)錄活性，但其對JAK2V617F和TET2雙突變MPN患者具體作用尚未明確。

本研究通過建立TET2-KD HEL細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)相較于EV HEL，TET2-KD HEL細(xì)胞增殖能力增加，且TET2-KD HEL對地西他濱存在耐藥現(xiàn)象。為了探索新的聯(lián)合用藥方案，我們將蘆可替尼和地西他濱聯(lián)合應(yīng)用于EV HEL和TET2-KD HEL，發(fā)現(xiàn)該組合在TET2-KD HEL中有協(xié)同作用。有研究報道JAK2可以在酪氨酸1939和1946位點(diǎn)使TET2磷酸化，而磷酸化的TET2與類紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子KLF1相互作用導(dǎo)致紅系祖細(xì)胞的激活而促進(jìn)MPN疾病的發(fā)生和進(jìn)展。在MPN患者樣本和小鼠模型中發(fā)現(xiàn)激活的JAK2V617F突變與TET活性和胞嘧啶羥甲基化的變化有關(guān)。這些表觀遺傳和功能變化也與一些致癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加有關(guān)。且在MPN患者樣本中發(fā)現(xiàn)JAK2V617F單突變的患者全基因組胞嘧啶甲基化顯著降低，而在JAK2V617F和TET2并沒發(fā)生該現(xiàn)象[17]。以上結(jié)果提示JAK2V617F和TET2雙突變患者的甲基化異常狀態(tài)可能是其對地西他濱耐藥的主要原因。

總之，該研究證實(shí)TET2敲降后JAK2V617F陽性的HEL 細(xì)胞系對地西他濱耐藥，蘆可替尼和地西他濱在TET2-KD HEL有協(xié)同抑制作用。提示在TET2和JAK2V617F雙突變MPN患者中聯(lián)合應(yīng)用蘆可替尼和地西他濱可能是一種有效可行的治療方案。