RhoA激酶的硫巰基化修飾在硫化氫抗大鼠神經(jīng)細(xì)胞缺氧性損傷中的作用

謝偉明，陳志武，郭 巖

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

硫巰基化(S-sulfhydration)是繼乙酰化(acetylation)和磷酸化(phosphorylation)等之后發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[1]，硫巰基化修飾可以被二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)等還原劑抑制[2]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是機(jī)體內(nèi)一種重要的氣體信號分子[3]，與多種生理及病理過程有關(guān)。H2S具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗炎癥反應(yīng)、保護(hù)血腦屏障等效應(yīng)[4]。有研究表明，H2S可通過硫巰基化修飾靶蛋白的半胱氨酸殘基，使半胱氨酸的-SH基團(tuán)轉(zhuǎn)化為-SSH或過硫酸鹽基團(tuán)，改變靶蛋白的生物學(xué)功能，如H2S硫巰基化修飾ATP敏感性鉀離子(KATP)通道蛋白的半胱氨酸殘基，進(jìn)而影響該通道開放[5]。

RhoA-Rho激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機(jī)體內(nèi)一種與細(xì)胞的生長、增殖和分化等功能有關(guān)的信號通路，與高血壓和缺血性腦損傷等血管性疾病密切相關(guān)。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，有ROCK1和ROCK2兩種亞型，ROCK2主要表達(dá)在大腦、心臟和肌肉中[6]。有研究表明ROCK2激活促進(jìn)缺血性神經(jīng)元損傷，而抑制ROCK2活性或者降低ROCK2蛋白表達(dá)，可減輕神經(jīng)元損傷[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)H2S對小鼠腦缺血損傷具有明顯保護(hù)作用，并可抑制小鼠腦血管平滑肌細(xì)胞中ROCK2活性[8]。但是，H2S抑制ROCK2活性的機(jī)制至今未見明確報道。鑒于ROCK2分子結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸富集的鋅指樣結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich zine finger-like motifdomain，CRD)中富含半胱氨酸殘基[9]，H2S是否通過硫巰基化修飾來抑制神經(jīng)細(xì)胞中ROCK2活性抗神經(jīng)細(xì)胞H/R損傷？因此，本研究擬探討H2S是否可通過抑制ROCK2對大鼠神經(jīng)細(xì)胞H/R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用及其ROCK2抑制作用的硫巰基化修飾機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑ROCK2抗體，購自Abcam公司，批號：125025；NaHS，購自Sigma公司，批號：#SHBF1746V；鏈霉親和素瓊脂糖珠，購自北京博爾西科技有限公司，批號：B190319；ROCK2活性試劑盒，購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號：0069R1；Biotin-HPDP，購自APExBIO公司，批號：A800831337769；細(xì)胞凋亡試劑盒，購自北京四正柏生物有限公司，批號：20200820；二硫蘇糖醇(DTT)，購自阿拉丁試劑有限公司，批號：D8220。

1.2 儀器流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；凝膠電泳儀和電泳槽(美國BIO-RAD公司)；TGL-16H超速冷凍離心機(jī)(珠海黑馬儀器有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)

1.3 動物SPF級SD大鼠新生鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK(皖)2017-001。

1.4 方法

1.4.1原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞[10]取新生24 h內(nèi)的SD大鼠，在麻醉狀態(tài)下斷頭取腦并剝離海馬組織，0.125%胰酶液消化20 min，加入10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，巴氏吸管將組織吹散，70 μm細(xì)胞過濾器過濾，1 000 r·min-1常溫離心5 min并留沉淀。加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×107個·L-1，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被好的6孔板中，24 h后用專用培養(yǎng)基(Neurobasal+2% B27+0.5 mmol·L-1L-glutamine+1%青霉素-鏈霉素溶液)半量換液，每隔3 d全量換液。

取培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，用4%的多聚甲醛室溫固定10 min，PBS溶液清洗后，加0.3% Tritonx-100放置30 min。棄掉Tritonx-100，清洗3遍，滴加10%山羊血清工作液封閉30 min。加1 ∶100稀釋的一抗MAP2，4 ℃放置過夜，次日清洗后滴加同樣稀釋倍數(shù)的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗，室溫避光放置1 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，進(jìn)行海馬神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定。

1.4.2硫巰基化蛋白的分離純化 采用改良生物素轉(zhuǎn)換法[1]分離純化硫巰基化蛋白。在培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中分別加入50、100、200 μmol·L-1NaHS或等體積的生理鹽水(NS)培養(yǎng)24 h后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液為每mL含有1×105個神經(jīng)元，取500 μL細(xì)胞懸液置于6孔培養(yǎng)板中，加入100 μL的蛋白裂解液，置冰盒上裂解30 min，離心取上清并進(jìn)行蛋白定量。將200 μL上清液加入2 mL離心管中，再加入800 μL甲基硫代磺酸甲酯(Methyl methanethiosulfonate，MMTS)和HENS緩沖液配制的終止緩沖液，50 ℃恒溫水浴30 min，封閉剩余的游離巰基。加入1 mL-20 ℃預(yù)冷的丙酮靜置30 min后15 000 r·min-14 ℃離心20 min。加入1 mL HENS緩沖液將留下的沉淀吹打溶解。再加入250 μL Biotin-HPDP工作液混勻，室溫避光放置過夜。次日再加滿-20 ℃預(yù)冷的丙酮，-20 ℃冰箱中靜置30 min，立即12 000 r·min-14 ℃離心20 min，棄上清。加入1 mL HENS緩沖液吹打溶解，加入50 μL鏈霉親和素瓊脂糖珠，室溫避光放置24 h。再12 000 r·min-1離心2 min后棄上清，用HENS緩沖液重懸瓊脂糖珠并反復(fù)離心洗滌3次，用洗脫緩沖液洗脫瓊脂糖珠后得到純化的硫巰基化蛋白。

1.4.3ROCK2或硫巰基化ROCK2(SSH-ROCK2)的蛋白含量檢測 神經(jīng)元總蛋白或硫巰基化蛋白中的ROCK2含量分別用Western blot法測定。將100 μg的總蛋白或硫巰基化蛋白置100 ℃變性后，在12% SDS聚丙稀酰胺凝膠中電泳后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，ROCK2一抗孵育過夜。次日加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。TBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯影并拍照以兔抗β-actin多克隆抗體為內(nèi)參照，Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.4.4ROCK2活性檢測 將培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為NS對照組和NaHS(200 μmol·L-1)組。NaHS或生理鹽水處理24 h后，將NaHS組進(jìn)行硫巰基化蛋白分離純化。采用Western blot法定量分析各組ROCK2蛋白的濃度，以灰度值的比值來調(diào)整ROCK2蛋白的濃度，待濃度一致后再進(jìn)行ROCK2活性檢測。將蛋白樣品加入到96孔板中，并設(shè)置空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測吸光度。

1.4.5神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型的建立 將原代海馬神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組、NaHS(50、100、200 μmol·L-1)組、硫巰基化抑制劑DTT組以及NaHS(200 μmol·L-1)+DTT組。除正常對照組外，細(xì)胞預(yù)處理24 h后棄去培養(yǎng)基加入缺氧液，置于90% N2-10% CO2三氣培養(yǎng)箱中孵育4 h，再更換成完全培養(yǎng)基置于正常三氣培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)孵育12 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.6CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取缺氧4 h/復(fù)氧12 h鋪滿96孔板(100 μL/孔)的神經(jīng)元，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4.7檢測培養(yǎng)上清中LDH、NSE水平 使用試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH和NSE活性。

1.4.8細(xì)胞凋亡檢測 將細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化吹打分離出后，加入1 ∶3稀釋的結(jié)合緩沖液。將5 μL Annexin V和10 μL碘化丙啶(PI)加入100 μL細(xì)胞懸液中避光放置5 min，立即檢測各組凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定取生長8 d的大鼠海馬細(xì)胞，用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物MAP2免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。如Fig 1所示，原代培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，和陰性對照組相比，胞體和軸突經(jīng)MAP2抗體染色呈綠色熒光，結(jié)果表明所培養(yǎng)的大鼠海馬細(xì)胞為神經(jīng)元。

2.2 NaHS對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的影響

2.2.1NaHS對細(xì)胞活力及LDH和NSE活性的影響 如Fig 2A所示，與正常對照組相比，H/R模型組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，而給予外源性H2S供體NaHS 100和200 μmol·L-1可顯著提高H/R損傷導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低(P<0.01，與模型組相比)；Fig 2B和Fig 2C顯示，相比正常對照組，H/R模型組細(xì)胞上清中LDH和NSE活性有明顯提高，提示H/R損傷細(xì)胞致NSE和LDH漏出增多。相比模型組，100和200 μmol·L-1NaHS可降低H/R導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞LDH和NSE的漏出(P<0.01)，50 μmol·L-1NaHS也可明顯降低神經(jīng)細(xì)胞H/R后培養(yǎng)上清中NSE活性。結(jié)果表明H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷有明顯的保護(hù)作用。Fig 2A、Fig 2B和Fig 2C還顯示，聯(lián)合應(yīng)用硫巰基化修飾阻斷藥DTT顯著阻斷200 μmol·L-1NaHS對H/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低和上清液中LDH和NSE活性增高的抑制作用(與200 μmol·L-1NaHS組相比，P<0.01)，對DTT單獨(dú)應(yīng)用對H/R損傷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力降低和細(xì)胞上清液中LDH和NSE活性增高無明顯的影響。以上結(jié)果表明，外源性H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的保護(hù)機(jī)制可能與蛋白質(zhì)的硫巰基化修飾有關(guān)。

2.2.2NaHS對細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢查結(jié)果(Fig 3A)顯示：H/R模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.01)，而50、100、200 μmol·L-1NaHS均可降低H/R對細(xì)胞凋亡率的影響(與模型組組相比，P<0.05)。結(jié)果表明H2S可抑制H/R損傷導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞活力及培養(yǎng)上清中LDH和NSE活性的改變相似，聯(lián)合應(yīng)用DTT可降低200 μmol·L-1NaHS對H/R損傷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用(與200 μmol·L-1NaHS組相比，P<0.01)，而DTT單獨(dú)應(yīng)用同樣對H/R損傷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡無明顯的影響。結(jié)果表明外源性H2S抗大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的機(jī)制與硫巰基化修飾有關(guān)。

Fig 1 Identification of rat neurons by MAP2 under fluorescence microscope (×100)

Fig 2 Protection of NaHS on H/R injury in rat neurons and effect of S-sulfhydration on protection n=6)

2.3 NaHS對大鼠海馬神經(jīng)元ROCK2蛋白表達(dá)和活性的影響原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，并給予不同濃度NaHS(50、100、200 μmol·L-1)。Western blot結(jié)果(Fig 4A)表明，與NS對照組相比，100和200 μmol·L-1NaHS可以降低大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中ROCK2蛋白的表達(dá)(P<0.01)；Fig 4B顯示200 umol·L-1NaHS可以降低海馬神經(jīng)細(xì)胞中ROCK2活性(與NS對照組相比，P<0.01)。結(jié)果表明H2S對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中ROCK2蛋白表達(dá)和活性均有明顯抑制作用。

Fig 4 Effects of NaHS on ROCK2 protein expression and activity in rat neurons n=3)

2.4 NaHS促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元中ROCK2的硫巰基化原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，并給予不同濃度NaHS(50、100、200 μmol·L-1)，24 h后，經(jīng)過生物素化處理得到各組硫巰基化修飾蛋白，以硫巰基化修飾ROCK2蛋白量和總ROCK2蛋白量二者比值來定量分析NaHS對硫巰基化修飾ROCK2蛋白的影響，結(jié)果如Fig 5所示，與NS對照組相比，NaHS 100和200 μmol·L-1孵育24 h可提高原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中硫巰基化ROCK2(SSH-ROCK2)蛋白的含量(P<0.01)，表明H2S可促進(jìn)海馬神經(jīng)元中ROCK2蛋白的巰基化修飾。

Fig 5 Effect of NaHS on protein level of S-sulfhydration ROCK2(SSH-ROCK2)in rat neurons n=3)

2.5 硫巰基化對ROCK2活性的影響為觀察硫巰基化對ROCK2活性的影響，本研究從分別對照組和NaHS處理組海馬神經(jīng)元中提取總蛋白，分離純化NaHS處理組細(xì)胞的硫巰基化蛋白，運(yùn)用Western blot調(diào)整對照組總蛋白中的ROCK2蛋白含量與NaHS處理組硫巰基化蛋白中的SSH-ROCK2蛋白含量相等，繼而測定ROCK2活性。結(jié)果如Fig 6所示，200 μmol·L-1NaHS處理組細(xì)胞中的SSH-ROCK2活性明顯低于對照組細(xì)胞中的ROCK2活性，提示ROCK2硫巰基化修飾可明顯降低其活性。

Fig 6 Effect of S-sulfhydration on ROCK2 activity in rat neurons n=3)

3 討論

腦缺血/再灌注損傷是目前臨床上高致殘率、高致死率的主要疾病之一[11]。腦缺血/再灌注損傷以及細(xì)胞的H/R損傷均可導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，造成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的一些重要酶，比如LDH和NSE的外漏[12]。本研究在大鼠海馬神經(jīng)元H/R模型上，發(fā)現(xiàn)外源性H2S供體NaHS明顯抑制H/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)清液中LDH和NSE活性增高，表明H2S可抑制H/R損傷導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元中LDH和NSE的外漏。同時，NaHS還可抑制H/R損傷誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的活力降低和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步明確H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷有明顯的保護(hù)作用。

Chang等[13]發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK2信號通路參與了腦缺血/再灌注損傷，而抑制ROCK2蛋白的表達(dá)可抑制腦缺血/再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)NaHS 100和200 μmol·L-1對大鼠海馬神經(jīng)元中ROCK2蛋白表達(dá)和活性有明顯的抑制作用，這與我們以前報道的H2S可抑制小鼠平滑肌細(xì)胞中ROCK2活性[9]是一致的。因此，我們的結(jié)果提示H2S對海馬神經(jīng)元H/R損傷保護(hù)作用可能與抑制ROCK2蛋白表達(dá)和活性有關(guān)。但是H2S抑制ROCK2活性的機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

近年來的研究表明，H2S可將某些靶蛋白半胱氨酸殘基的SH基團(tuán)轉(zhuǎn)化為-SSH或過硫酸鹽基團(tuán)，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，這被稱為硫巰基化(S-sulfhydration)修飾[5]。硫巰基化修飾是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，如H2S通過硫巰基化修飾血管平滑肌細(xì)胞的KATP通道，可引起通道的開放和鉀離子外流而導(dǎo)致血管舒張[14]。RhoA-ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。ROCK是RhoA最直接的效應(yīng)分子，在腦細(xì)胞中，以ROCK2表達(dá)為主。鑒于ROCK2分子結(jié)構(gòu)中含有較多的半胱氨酸殘基[15]，H2S有可能通過半胱氨酸殘基來硫巰基化修飾轉(zhuǎn)錄表達(dá)的ROCK2，并進(jìn)而影響ROCK2活性。本研究通過改良生物素轉(zhuǎn)換法[1]分離純化硫巰基化蛋白，并結(jié)合Western blot法檢測了硫巰基化蛋白中的SSH-ROCK2，結(jié)果表明100、200 μmol·L-1NaHS可以增加大鼠海馬神經(jīng)元中的SSH-ROCK2蛋白水平，證實(shí)了H2S可硫巰基化修飾大鼠海馬神經(jīng)元中的ROCK2。靶蛋白翻譯后的修飾可影響其功能。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NaHS組大鼠海馬神經(jīng)元中的SSH-ROCK2活性明顯低于對照組中的ROCK2活性，表明H2S硫巰基化大鼠海馬神經(jīng)元中的ROCK2，并抑制其活性，這可能是H2S保護(hù)大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷作用的重要機(jī)制之一。

硫巰基化修飾可被DTT等還原劑所逆轉(zhuǎn)[2]。本研究在在大鼠海馬神經(jīng)元H/R模型上，觀察到了DTT可明顯地阻斷200 μmol·L-1NaHS對H/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低、細(xì)胞中LDH和NSE外漏及細(xì)胞凋亡的抑制作用，結(jié)果提示硫巰基化修飾參與了H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的保護(hù)作用，這與H2S硫巰基化ROCK2并抑制其活性的結(jié)果是一致的，但也不能排除H2S對如KATP通道等其它蛋白質(zhì)的硫巰基化是否也參與了其保護(hù)作用，今后研究需要進(jìn)一步明確。本研究首次闡明了H2S介導(dǎo)的硫巰基化修飾發(fā)生在RhoA-ROCK信號通路RhoA激酶2(ROCK2)中。也首次闡明了H2S介導(dǎo)的ROCK2硫巰基化修飾是H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制之一，為腦缺血/再灌注損傷的臨床研究提供了一個新的方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與硫巰基化修飾致ROCK2活性降低及ROCK2蛋白表達(dá)減少有關(guān)。