CP-25抑制Th17細胞分化改善MRL/lpr狼瘡小鼠腎損傷

黃李娜，王盛付，王 祥，徐 靚，袁曉陽，蒯佳婕，魏 偉，嚴尚學

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協同創新中心，安徽 合肥 230032)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因復雜的全身性疾病[1]，其異常免疫產生的大量自身抗體與自身抗原形成免疫復合物沉積，可導致多種臟器和結締組織損傷。腎臟是SLE病情發展變化過程中常見的受累臟器，多發展為狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)，LN不僅是影響SLE預后的重要因素，也是引起終末期腎臟病的常見原因，需要進行積極防治。輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)在SLE和慢性炎癥性疾病的發生、發展中起著至關重要的作用。白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)是Th17細胞分泌的一種促炎細胞因子，與多種自身免疫病發病機制有著密不可分的聯系[2-3]。在SLE患者和易患狼瘡的小鼠中發現Th17細胞數量增加和IL-17水平升高，患者血漿中IL-17水平與腎臟病變及狼瘡活動指數呈正相關[4]，這些都提示Th17和IL-17的水平與SLE疾病發生發展相關。

芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)為本課題組合成的新型化合物。研究發現，CP-25 可調節T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突細胞等多種免疫細胞功能，對類風濕關節炎、干燥綜合征等自身免疫性疾病動物模型均具有較好的治療作用[5]。SLE以T細胞、B細胞等多種免疫細胞功能紊亂造成的自身免疫為特征，臨床主要以激素類和免疫抑制劑治療，缺少高效、低毒的治療藥物。CP-25作為天然藥物來源的小分子化合物，是否可以通過抑制Th17細胞分化、調節炎癥免疫反應對SLE發揮治療作用尚未見報道。MRL/lpr小鼠由于Fas基因缺失，表現為淋巴細胞異常增殖、腎功能損傷、抗雙鏈DNA(anti-dsDNA)水平升高，表現與人類狼瘡樣臨床特征類似，故常用作SLE的動物模型。基于此，本實驗擬探究CP-25對MRL/lpr狼瘡小鼠腎臟損傷的治療作用及調控Th17細胞分化的機制，為CP-25臨床用于LN防治提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑CP-25為純度大于98%的白色粉末，由安徽醫科大學臨床藥理研究所提供，使用時溶解于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中。醋酸潑尼松(批號：180505)為浙江仙琚制藥產品；抗小鼠CD3-PE(批號：8051834)、CD4-FITC(批號：8361803)、IL-17A-PE(批號：8302116)、CD69-PE-cy7(批號：8046564)流式抗體為BD Biosciences公司產品；STAT3(批號：7)和p-STAT3(批號：34)抗體為CST公司產品；抗RORγt抗體(批號：NBP2-24449)為Novus公司產品；CD3(批號：B302116)、CD28(批號：B308009)單克隆抗體、重組小鼠TGF-β(批號：B302236)、IL-6(批號：B309018)和IL-23(批號：B304416)為Biolegend公司產品；抗小鼠IL-17A預包被ELISA檢測盒(批號：1211702)購自達科為生物技術公司、小鼠抗雙鏈DNA(IgG)Elisa檢測盒(批號：M10014300)購自武漢華美生物技術公司；佛波肉豆蔻醋酸(PMA)(批號：B302116)、離子霉素(批號：FMS20190819001)、布雷非德菌素A(BFA)(批號：FMS2019122301)和刀豆蛋白(ConA)(批號：FMS20190619001)購自福麥斯公司。

1.2 動物SPF級MRL/lpr小鼠，♀，40只，(25-35)g，10-12周，購自上海斯萊克有限責任公司,SCXK(滬)2017-0005；SPF級BALB/c小鼠，♀，8只，(20-25)g，10-12周，購于安徽醫科大學SPF級實驗動物中心,SCXK(皖)2017-001。本實驗已通過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準。

1.3 主要儀器瑞士Tecan公司全波長多功能酶標儀(型號：Infinite M1000 Pro)、美國Beckman公司流式細胞儀(型號：CytoFLEX)、美國GE公司熒光及化學發光成像系統(型號：ImageQuant LAS 4000)、ABI公司實時熒光定量PCR系統(型號：7500)。

2 方法

2.1 實驗分組與給藥將MRL/lpr小鼠隨機分為5組，分別為模型組、CP-25組(20、40、80 mg·kg-1)和醋酸潑尼松(5 mg·kg-1)組，另設BALB/c小鼠為正常對照。動物飼養在SPF級動物實驗室，給予正常飲食飲水，采用半定量尿蛋白試紙測量小鼠的尿蛋白水平，當尿蛋白大于1 μg·L-1時開始給藥，正常組和模型組均給予等量溶媒。給藥6周后，眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠。將眼眶血靜置2 h，2 000 r·min-1離心10 min，收集上清，即為血清，-80 ℃保存備用。

2.2 組織病理學檢查處死小鼠，打開腹腔，取出腎臟，置于組織固定液中24 h，石蠟包埋后，制成薄的組織切片，HE染色。置于40倍物鏡下觀察，拍照，分析各組小鼠腎臟組織病理學改變情況。

2.3 脾臟指數以及T細胞增殖的檢測無菌環境中取出脾臟，稱量脾臟重量，按照每100 g體質量的脾臟質量比，計算脾臟指數。

將脾臟置于無菌培養皿中，加淋巴細胞分離液研磨，過200目篩后800×g離心30 min，取中間玻璃層，加生理鹽水洗滌，離心，得到的淡黃色沉淀即是脾臟淋巴細胞。加生理鹽水重懸，調整脾臟淋巴細胞懸液濃度(1×1010個·L-1)，在96孔培養板上每孔加入100 μL細胞懸液(終濃度為5×109·L-1)和ConA(終濃度3 mg·L-1)，終容積為200 μL，各設3個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h，加入20 μL CCK-8試劑，避光37 ℃孵育1-3 h，酶標儀檢測A450 nm值，分析統計。

2.4 體外誘導Th17細胞分化制備小鼠脾淋巴細胞懸液并調整適宜細胞濃度。先用抗CD3單抗(5 mg·L-1)包被96孔板，37 ℃孵育2 h后置于4 ℃備用。在孔板中先加入100 μL細胞，再加入CD28(2.5 mg·L-1)、TGF-β(20 mg·L-1)、IL-6(10 mg·L-1)和IL-23(30 μg·L-1)建立誘導Th17分化條件，最后分別加入不同濃度的CP-25(1×10-5，1×10-6和1×10-7mol·L-1)，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養5 d，定向誘導T細胞向Th17細胞分化。另設立分化對照組，不加CP-25。培養5 d后離心取上清，下層細胞團加入TRIzol置于-80 ℃備用。

2.5 流式細胞術檢測T細胞亞群常規制備小鼠脾臟淋巴細胞懸液，調細胞至適宜濃度，分別加入CD3-PE、CD4-FITC和CD69-PE-cy7流式抗體，4 ℃孵育40 min后洗滌離心，重懸后上機檢測CD3+細胞及CD4+CD69+細胞比例。

Th17細胞比例檢測：收集小鼠脾臟淋巴細胞和體外誘導后的細胞，用PMA、離子霉素和BFA混合物刺激處理4 h后，離心，收集細胞團重懸，加入CD4-FITC，4 ℃避光孵育45 min；經固定破膜處理后加入IL-17A-PE，4 ℃避光30 min，洗滌離心，重懸上機，檢測CD4+IL-17A+細胞比例。

2.6 熒光定量PCR檢測IL-17A的mRNA水平用TRIzol一步法獲取小鼠脾臟和體外誘導后細胞中的總RNA，定量合成cDNA，將擴增試劑、引物和cDNA按照說明書混合，按說明書設定程序擴增，以GAPDH為參照，采用相對定量法=2-ΔΔT分析熒光定量結果。相關引物序列如下：

IL-17A：F 5′-TTCAGGGTCGAGAAGATGCT-3′，R 5′-AAACGTGGGGGTTTCTTAGG-3′；

GAPDH：F 5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，R 5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′。

2.7 Western blot檢測相關蛋白表達收集小鼠脾臟組織和實驗細胞，按比例(組織裂解液 ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)加入，充分研磨，冰上裂解30 min后離心取上清得到總蛋白，BCA蛋白定量；電泳；轉膜；室溫5%牛奶封閉90 min；加入一抗(STAT3、p-STAT3、RORγt和β-actin)4 ℃孵育過夜；次日洗滌后加入二抗37 ℃孵育90 min；洗膜顯影。采用Image J軟件進行目的蛋白的灰度值檢測并進行統計分析。

2.8 ELISA法檢測自身抗體與細胞因子水平檢測小鼠血清中抗dsDNA、IL-17A水平以及細胞培養上清中IL-17A的水平，按照試劑盒說明書進行實驗操作，將稀釋好的標準品和樣品加入酶標板中，設空白對照，加檢測抗體，孵育，洗滌，加酶孵育，再次洗滌，加顯色液反應5-30 min后，加終止液，10 min內，采用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的IOD值，依據說明書以及蛋白標準曲線計算蛋白濃度。

2.9 統計學處理應用SPSS 20.0軟件分析實驗所得數據，采用One-Way ANOVA分析方法比較多組間數據，使用 GraphPad Prism 6.0軟件繪制結果統計圖。

3 結果

3.1 CP-25對MRL/lpr小鼠腎臟病理的影響檢測小鼠腎臟組織病理學(Fig 1)結果顯示，MRL/lpr小鼠腎臟體積明顯增大，鏡下可見腎小球球體增大變形，腎小球基底膜斷裂(a)，入球小動脈玻璃樣變性(b)，腎間質有大量炎性細胞浸潤(c)，系膜細胞異常增生(d)；CP-25給藥可明顯抑制腎小球形變，減輕腎小球炎性細胞浸潤，抑制系膜細胞的異常增生，對小鼠腎臟病理有明顯改善作用。

Fig 1 Effect of CP-25 on renal pathology in MRL/lpr mice(×400)

3.2 CP-25對MRL/lpr小鼠脾臟指數和T淋巴細胞增殖反應的影響脾臟指數統計結果(Fig 2A)顯示，與正常組比較，MRL/lpr小鼠的脾臟指數明顯增高(P<0.01)；CP-25(20、40、80 mg·kg-1)和醋酸潑尼松(5 mg·kg-1)給藥均可明顯降低小鼠脾臟指數(P<0.01)。T細胞增殖能力統計結果顯示(Fig 2B)，與正常組比較，模型組動物的T細胞增殖能力增加(P<0.01)，CP-25和醋酸潑尼松給藥可不同程度地抑制T淋巴細胞增殖(P<0.05，0.01)。

Fig 2 Effect of CP-25 on spleen index and T cell proliferation of splenic lymphocytes of MRL/lpr mice n=6)

3.3 CP-25對MRL/lpr小鼠T細胞亞群百分比的影響流式細胞術檢測結果(Fig 3)顯示，與正常組相比較，MRL/lpr小鼠總T細胞(CD3+)、活化T細胞(CD4+CD69+)與Th17細胞(CD4+IL-17+)的比例均明顯升高(P<0.05)；CP-25(20、40和80 mg·kg-1)及醋酸潑尼松(5 mg·kg-1)給藥均可不同程度地降低其比例(P<0.05,0.01)。

3.4 CP-25對MRL/lpr狼瘡鼠脾臟組織中IL-17A的mRNA水平的影響qPCR檢測結果表明(Fig 4)，與正常組比較，MRL/lpr小鼠脾臟組織中的IL-17A mRNA表達升高(P<0.01)；與模型小鼠比較，CP-25和醋酸潑尼松給藥均可降低IL-17A的mRNA表達水平(P<0.05)。

3.5 CP-25對MRL/lpr小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平的影響檢測小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平(Fig 5)發現，模型小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平均明顯升高(P<0.01)；CP-25和醋酸潑尼松給藥可降低小鼠血清中抗dsDNA(P<0.01)和IL-17A水平(P<0.01)。

Fig 3 Effect of CP-25 on T cell subsets in splenic lymphocytes of MRL/lpr mice n=6)

Fig 4 Effect of CP-25 on IL-17A mRNA expression level in spleen tissues of MRL/lpr mice n=6)

Fig 5 Effect of CP-25 on serum level of anti-dsDNA and IL-17A in MRL/lpr mice n=6)

3.6 CP-25對MRL/lpr小鼠脾臟中RORγt和p-STAT3蛋白表達的影響檢測小鼠脾臟組織中的RORγt和p-STAT3的蛋白表達水平，模型小鼠RORγt和p-STAT3水平升高(P<0.01)，但總的STAT3水平無明顯差異(Fig 6A)；CP-25和醋酸潑尼松給藥后，各給藥組脾臟組織中上述目的蛋白表達相對于模型組均有不同程度降低(P<0.05,P<0.01)(Fig 6B)，各組總STAT3無明顯變化。

3.7 CP-25體外給藥對Th17細胞誘導分化的影響

3.7.1CP-25體外給藥對誘導Th17細胞百分比的影響 為了進一步觀察CP-25對Th17細胞分化的影響，體外采用TGF-β、IL-6和IL-23誘導小鼠脾臟單個核淋巴細胞向Th17細胞分化。流式細胞術檢測結果顯示(Fig 7)，誘導刺激后的Th17細胞百分比明顯升高(P<0.01)，體外給予CP-25(10-5、10-6、10-7mol·L-1)后，Th17細胞亞群比例減少(P<0.01)。

3.7.2CP-25體外對誘導脾臟淋巴細胞中RORγt和p-STAT3蛋白表達的影響 進一步檢測體外誘導的小鼠脾臟淋巴細胞的RORγt和p-STAT3蛋白表達情況，結果顯示(Fig 8)，與非刺激誘導組比較，誘導刺激細胞的RORγt(P<0.01)和p-STAT3(P<0.05)的蛋白表達水平明顯升高，CP-25均可不同程度降低RORγt(P<0.05)和p-STAT3(10-5、10-6mol·L-1，P<0.05)蛋白表達水平，各組總STAT3水平無明顯變化。

Fig 6 Effect of CP-25 on expression of p-STAT3 and RORγt protein in spleen tissues of MRL/lpr mice n=3)

Fig 7 Effect of CP-25 on Th17 cell percentage in vitro

Fig 8 Effect of CP-25 on expression of p-STAT3 and RORγt protein in mouse splenic lymphcytes n=3)

3.7.3CP-25體外對誘導脾臟淋巴細胞的IL-17A mRNA水平和上清培基中細胞因子IL-17A的影響 在刺激劑誘導細胞向Th17方向分化后，細胞培養上清中的IL-17A水平相對于對照組明顯上升(Fig 9A)，CP-25(10-5、10-6、10-7mol·L-1)可明顯降低IL-17A水平(P<0.01)。收集細胞，檢測IL-17A mRNA水平結果顯示(Fig 9B)，刺激劑誘導后IL-17A mRNA水平明顯升高，CP-25(10-5、10-6、10-7mol·L-1)同樣可以降低IL-17A mRNA水平(P<0.01)。

Fig 9 Effect of CP-25 on level of IL-17A cytokines and expression of IL-17A mRNA in n=4)

4 討論

SLE是一種慢性系統性自身免疫病，由先天性和適應性免疫系統的異常激活引起。大量自身抗體的生成并沉積于臟器可導致多器官損傷，尤其是腎臟的損傷，出現蛋白尿、腎臟衰竭，嚴重的可危及生命。CP-25對小鼠膠原性關節炎、大鼠佐劑性關節炎以及小鼠干燥綜合征等自身免疫病模型具有明顯治療作用[6]。MRL/lpr小鼠是經典的自發性SLE動物模型，以T細胞激活、產生大量自身抗體等免疫功能紊亂為特征、導致脾臟病理性腫大和明顯的間質性腎炎。本研究結果表明，CP-25可降低MRL/lpr小鼠脾臟指數，降低血清中抗dsDNA水平，抑制腎小球形變，減輕腎小球炎癥性細胞浸潤，抑制系膜細胞的異常增生，提示CP-25對MRL/lpr小鼠的腎臟病變具有明顯的治療作用。

在SLE發病過程中，T細胞亞群比例和功能明顯異常，在促進炎性細胞因子產生和浸潤靶組織等方面發揮重要作用[7]。作為主要的促炎性T細胞亞群，Th17細胞主要分泌特異性促炎細胞因子IL-17，參與了SLE治療中的糖皮質激素抵抗，募集單核細胞和中性粒細胞并刺激產生各種炎性介質，促進生發中心的形成和自身免疫發展[8]。SLE患者血清中IL-17水平與疾病活動度、抗dsDNA水平之間也存在正性相關。維A酸相關孤獨受體γ-t(retinoic acid-related orphan nuclear hormone receptor γ-t，RORγt)是一種特異性轉錄因子，參與Th17細胞分化和功能調控，缺少RORγt會導致Th17細胞活性下降，IL-17表達水平嚴重降低。本研究中，CP-25給藥可明顯降低MRL/lpr小鼠總T細胞(CD3+)、活化T細胞(CD4+CD69+)以及Th17細胞(CD4+IL-17+)比例，降低小鼠血清中IL-17A水平，同時，還可以降低脾臟組織中IL-17A的mRNA表達水平以及RORγt的蛋白表達水平，這些結果均表明CP-25可有效降低MRL/lpr小鼠體內Th17細胞的比例。

信號轉導子及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription proteins，STAT3)可調控IL-17分泌、T細胞分化和促進T細胞遷移，抑制STAT3信號可以延遲狼瘡易發小鼠自身免疫的發生[9]，降低淋巴細胞積累，抑制T細胞遷移，從而改善腎臟損傷。STAT3信號在狼瘡患者中明顯異常，腹腔注射小分子STAT3抑制劑可延緩MRL/lpr小鼠的蛋白尿發作并降低自身抗體滴度[10]，在T細胞中不表達STAT3的狼瘡小鼠也不會發展為淋巴結病、脾腫大或腎小球腎炎[11]。通過使用基因敲除小鼠模型，已證明STAT3能與Th17細胞的IL-17啟動子直接結合[12]，提示T細胞特異性STAT3缺失可顯著影響IL-17的表達。在本研究中，MRL/lpr小鼠脾臟組織中STAT3蛋白的磷酸化水平明顯升高，給予CP-25治療后的小鼠p-STAT3降低。在體外誘導小鼠脾臟淋巴細胞向Th17分化，加入CP-25后，STAT3磷酸化水平亦降低，RORγt轉錄因子蛋白表達減少，從而降低Th17比例，IL-17A mRNA相對表達水平下降，上清分泌的IL-17A細胞因子明顯減少。這些結果提示CP-25可抑制T淋巴細胞向Th17細胞分化，降低Th17細胞比例和IL-17產生。

綜上所述，CP-25可明顯改善MRL/lpr小鼠腎臟病變，其機制與降低p-STAT3水平，抑制Th17分化和IL-17產生有關。