上皮黏附分子通過誘導(dǎo)EMT促乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥

師銳贊，何倚帆，牛亞楠，高 宇，陳 敏，張軒萍

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，是女性癌癥相關(guān)的第一大死因，嚴(yán)重危害女性健康。近年乳腺癌的診治已取得重要進展，但轉(zhuǎn)移和耐藥仍是多數(shù)乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌患者轉(zhuǎn)移灶內(nèi)腫瘤細胞的耐藥性明顯增強，治療棘手，平均壽命僅2-3年[1]。因此，探尋與轉(zhuǎn)移和耐藥均相關(guān)的關(guān)鍵分子是改善乳腺癌預(yù)后的重要舉措。

上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是表達于上皮細胞的I型跨膜糖蛋白，參與細胞黏附、遷移、增殖和分化等過程，在多種惡性腫瘤(如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等)呈異常表達。EpCAM對腫瘤干細胞的干性維持也有突出意義，是防治惡性腫瘤的新靶點[2]。研究證實[3]，EpCAM過表達是乳腺癌療效差和預(yù)后不良的重要原因之一[3]，但其機制尚未闡明。本研究主要探究EpCAM在乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥中的作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，Cellmax，貨號：SA112.02)；乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP，Sangon Biotech，貨號：D155255)；Transwell 24孔板(Corning，貨號：3422)；Matrigel膠(Corning，貨號：356234)；EpCAM多抗(Boster，貨號：PB1115)；E-cadherin多抗(Boster，貨號：PB9561)；N-cadherin多抗(Boster，貨號：BA0673)；β-actin單抗(Boster，貨號：BM0627)；vimentin多抗(ABclonal，貨號：A19607)；β-catenin單抗(Santa Cruz Biotechnology，貨號：8480)；active β-catenin 單抗(Cell Signaling Technology，貨號：8814)；Lipofectamine 2000(Thermofisher，貨號：11668-027)；siRNA序列設(shè)計及合成(Public Protein/Plasmid Library，貨號：PPL0038-3a/b/c)。

1.2 主要實驗儀器恒溫培養(yǎng)箱(型號：371)購自美國Thermo公司；倒置顯微鏡(型號：AE2000)購自廈門麥克奧迪電氣股份有限公司；超凈工作臺(型號：ZHJH-C1112C)購自上海智城分析儀器制造有限公司；Western blot凝膠成像系統(tǒng)(Biorad GelDoc XR)購自美國Bio-rad公司。

1.3 細胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所熊冬生教授饋贈，培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.4 組織樣本本研究收集2012年8月-2013年3月山西省腫瘤醫(yī)院(太原，中國)行手術(shù)切除術(shù)的60例女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者(臨床Ⅰ～Ⅲ期，其中34例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，26例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，并收集距腫瘤邊緣約5 cm非腫瘤癌旁組織(adjacent non-tumor tissues，ANTTs)。浸潤性導(dǎo)管癌患者均為首次確診，術(shù)前未進行放化療。本研究經(jīng)過山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，按照《赫爾辛基宣言》及其后來修訂的所有原則進行。所有患者均簽署了知情同意書。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按3.5×105個/孔種至6孔板。待其融合率達約70%時，用Lipofectamine 2 000將siRNAEpCAM 和陰性對照siNC(negative control, NC)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞中，72 h后行Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率。siRNAEpCAM-1序列：5′-CTACAAGCTGGCCGTAAAC-3′；siRNAEpCAM-2序列：5′-GTTTACGGCCAGCTTGTAG-3′；siNC序列：5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGTT-3′。

1.6 免疫組織化學(xué)染色厚3 μm的組織切片脫蠟至水，用3%過氧化氫處理后進行抗原修復(fù)、10%山羊血清封閉后，加抗EpCAM抗體(1 ∶100稀釋，陰性對照用PBS代替)，4 ℃孵育過夜，與二抗孵育后經(jīng)DAB顯色后鏡下觀察并拍照。

1.7 Transwell實驗將Matrigel膠(1 g·L-1)包被Transwell小室(侵襲實驗，不涂者用于遷移實驗)，放置在24孔板內(nèi)，無菌臺內(nèi)自然風(fēng)干。將1×105(遷移)或2×104(侵襲)細胞接種于上室(培養(yǎng)基不含血清)。同時下室充入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下計數(shù)并拍照(×100)。

1.8 Western blot法收集細胞，提取蛋白確定其濃度后，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h后，用增強化學(xué)發(fā)光免疫分析法凝膠成像，并利用Image Lab軟件測定條帶灰度進行量化。

2 結(jié)果

2.1 EpCAM在乳腺癌轉(zhuǎn)移灶和三陰性乳腺癌細胞上調(diào)免疫組化結(jié)果顯示，與ANTTs相比，EpCAM在乳腺癌組織表達增多(P<0.05)，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)進一步上調(diào)(P<0.01)(Fig 1A, B)；相對于乳腺癌 MCF-7 細胞，EpCAM表達在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞上調(diào)(P<0.05)(Fig 1C, D)。

2.2 敲低EpCAM抑制MDA-MB-231細胞的遷移siRNA法靶向敲低MDA-MB-231細胞的EpCAM表達，Western blot檢測結(jié)果表明，與MDA-MB-231空白對照組相比，siNC組EpCAM表達變化不明顯，而敲低組siEpCAM-1和-2中EpCAM表達分別降低24.4%(P<0.05)和49.0%(P<0.01)(Fig 2A，B)。與EpCAM的干擾效率相一致，siNC組細胞的遷移和侵襲能力相對于空白對照組未發(fā)生明顯變化，而敲低組siEpCAM-1和-2的遷移和侵襲能力降低(Fig 2C)。

Fig 1 EpCAM is upregulated in metastatic breast cancer tissues and MDA-MB-231 cells

Fig 2 Migration and invasion ability of MDA-MB-231 cells inhibited by EpCAM knockdown

2.3 敲低EpCAM抑制BCRP介導(dǎo)的乳腺癌細胞耐藥相對于MCF-7細胞，MDA-MB-231細胞的BCRP表達上調(diào)(P<0.01)(Fig 3A，B)，而敲低組MDA-MB-231-siEpCAM-2中的BCRP表達明顯下調(diào)(P<0.01)(Fig 3C，D)。

Fig 3 BCRP expression in MDA-MB-231 cells reduced by EpCAM knockdown n=3)

2.4 敲低EpCAM逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相對于MCF-7細胞，MDA-MB-231細胞的E-cadherin下調(diào)、N-cadherin和vimentin上調(diào)(3者均P<0.01；Fig 4A，B)。與空白對照組MDA-MB-231細胞相比，陰性對照組MDA-MB-231-siNC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin變化不明顯(P>0.05)，而敲低組MDA-MB-231-siEpCAM-1和-2均可上調(diào)E-cadherin(P<0.05和P<0.01)，下調(diào)N-cadherin(P<0.01)和vimentin(P<0.01)(Fig 4C，D)。

2.5 EpCAM促乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥與Wnt/β-catenin通路有關(guān)相對于MCF-7細胞，Wnt通路的核心分子β-catenin在MDA-MB-231細胞上調(diào)(P<0.05；Fig 5A，B)；Wnt通路的特異性抑制劑 ICG-001(5、10 μmol·L-1)明顯抑制了非磷酸化的(active)β-catenin表達(P<0.05，P<0.01)，同時下調(diào)EpCAM(僅10 μmol·L-1P<0.01)、N-cadherin(P<0.05)、vimentin(P<0.01)表達(Fig 5C，D)。

Fig 4 EMT phenotypes in MDA-MB-231 cells partially reversed by EpCAM knockdown

Fig 5 EpCAM upregulated and EMT promoted by Wnt/β-catenin signaling in breast cancer n=3)

3 討論

EMT是多種腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的主要機制。EMT促進乳腺癌擴散到肝臟、肺或骨髓，是乳腺癌預(yù)后不良的重要原因[4]。BCRP過表達是乳腺癌耐藥的重要機制[5]。近年研究證實，EMT與BCRP介導(dǎo)的腫瘤耐藥也密切相關(guān)。肝癌和乳腺癌細胞EMT發(fā)生過程中，BCRP特異性上調(diào)[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于乳腺癌MCF-7細胞，三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的EMT表型明顯，且BCRP過表達，進一步證實了EMT與乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的相關(guān)性。因此，本研究選用侵襲和耐藥程度不同的兩種乳腺癌細胞，從EMT著手，探尋與乳腺癌轉(zhuǎn)移和BCRP介導(dǎo)的耐藥均相關(guān)的關(guān)鍵分子，以期為惡性乳腺癌的診斷和治療提供重要的分子靶點。

研究證實[8-9]，EpCAM可促進EMT發(fā)生。在鼻咽癌、結(jié)直腸癌細胞過表達EpCAM均可誘導(dǎo)EMT發(fā)生。敲低前列腺癌細胞EpCAM可抑制其干性和侵襲力[10]。但迄今尚無研究證實EpCAM在BCRP介導(dǎo)的腫瘤耐藥中的作用。本研究證實，EpCAM在乳腺癌患者轉(zhuǎn)移灶和三陰性乳腺癌細胞高表達；敲低EpCAM可降低MDA-MB-231細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，減少其BCRP表達，并逆轉(zhuǎn)其EMT。由此，我們推斷EpCAM可能通過誘導(dǎo)EMT促進乳腺癌轉(zhuǎn)移和BCRP介導(dǎo)的乳腺癌耐藥。

EpCAM促進乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機制值得進一步探討。Wnt/β-catenin信號通路是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等的經(jīng)典信號通路，EpCAM被證實為該通路的靶點之一[11]。正常情況下，β-catenin連接上皮標(biāo)志物E-cadherin至細胞骨架。Wnt通路被激活時，β-catenin入核致E-cadherin下調(diào)，誘導(dǎo)EMT發(fā)生，同時促進其靶基因(包括BCRP)的轉(zhuǎn)錄[12]。本研究結(jié)果也表明，與MCF-7細胞相比，MDA-MB-231細胞中 β-catenin 表達顯著升高；Wnt/β-catenin通路特異性抑制ICG-001可下調(diào)MDA-MB-231細胞的EpCAM和間質(zhì)標(biāo)記物(N-cadherin、vimentin)。這些結(jié)果均提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路參與EpCAM對乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的調(diào)節(jié)。

綜上所述，耐藥和轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌預(yù)后的兩大因素，也是臨床上亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究證實，EpCAM可誘導(dǎo)EMT，上調(diào)BCRP表達，是關(guān)聯(lián)乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵分子，且作用與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。本研究從分子水平闡明乳腺癌耐藥和轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)機制，為臨床上惡性乳腺癌的有效防治提供新思路和藥物作用的新靶點，具有重要的理論和臨床意義。