小分子化合物誘導人胚胎干細胞分化為角膜上皮樣細胞

肖文田，秦麗敏，刁玉梅，劉晶劼，王麗強

解放軍總醫院第一醫學中心 眼科，北京 100853

角膜是眼球最前端的無血管高度透明結構，分為5層，最外層為角膜上皮，由于直接暴露于外界環境，容易受到各種理化因素刺激而損傷，其再生主要依賴于角膜緣干細胞(limbal stem cells，LSCs)[1]。角膜盲是我國第二大致盲原因，約70%角膜盲由角膜緣干細胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)導致，主要表現為持續上皮缺損、新生血管入侵和角膜結膜化等[2]。近年來，隨著角膜緣上皮干細胞標志物的出現及培養技術和培養載體的不斷更新提高，利用細胞移植治療此類疾病成為研究熱點。目前，有多種不同方法用于誘導多能干細胞分化為角膜上皮細胞(corneal epithelial cells，CECs)。擬胚體是誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)或胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)在體外一定培養條件下形成的球狀結構，其形態與哺乳動物早期胚胎發育階段高度相似，具有向內、中、外3個胚層分化的潛能。本研究選用TGF-β通路抑制劑SB505124及經典Wnt信號通路抑制劑IWP-2兩種小分子化合物作用于擬胚體，阻斷TGF-β和Wnt通路，同時聯合堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)激活FGF通路，模擬了早期胚胎發育，使人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)向 外 胚層、體表外胚層方向分化，最終分化為角膜上皮細胞，為治療角膜盲提供了基礎實驗準備。

材料和方法

1 細胞、試劑及儀器 人胚胎干細胞H9細胞系(hESCs H9)購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司；基質膠(Matrigel)、超低黏附6孔板(Corning公司)；mTeSR1培養基、AggreWellTMEB Formation培養基、Y27632、AggreWellTM800 6孔板(Stemcell Technologies公司)；DMEM/F12、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)溶液、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)溶液(Gibco公司)；β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、Accutase溶液(Sigma公司)；血清替代物(KnockOutTMSerum Replacement，KSR)、SYBRTMSelect Master Mix(Invitrogen公司)；小分子化合物SB505124、IWP-2(MCE公司)；重組人成纖維細胞生長因子(recombinant human FGFbasic)(PeproTech公司)；EDTA溶液(Ambion公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Amresco公司)；不含鈣、鎂的磷酸鹽緩沖液(D-PBS)(索萊寶公司)；ProtoScript?ⅡFirst Strand cDNA Synthesis Kit(NEB公司)；兔抗人Oct4一抗(ab181557)、兔抗人p-63一抗(ab124762)、鼠抗人CK-3一抗(ab68260)(Abcam公司)；FITC山羊抗小鼠二抗(A0568)、FITC山羊抗兔二抗(A0562)(上海碧云天生物技術有限公司)。超凈工作臺、二氧化碳恒溫細胞培養箱(SANYO公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon公司)；倒置熒光共聚焦顯微鏡及圖像分析系統(Leica公司)；qRT-PCR儀(Bio-Rad公司)。

2 細胞培養 將凍存的hESCs H9復蘇，重懸于胚胎干細胞專用mTeSR1培養基，加入由Matrigel包被的孔板中，置于37°C、5% CO2細胞培養箱中培養，每天固定時間更換培養基，待細胞融合至85%左右時用0.5 mmol/L的EDTA消化重懸，按1∶3比例進行傳代培養。

3 細胞誘導 待hESCs融合至80%左右，生長狀態良好，用Accutase將其消化重懸于配制好的完全培養基(EB Formation 培養基加10 μmol/L Y27632)，調整細胞密度為1.2×106/mL，轉移至AggreWell孔板，置于37°C、5% CO2的細胞培養箱中培養，24 h后可見hESCs全部形成大小均一的擬胚體。將擬胚體轉移至超低黏附6孔板，加入EB培養基懸浮培養6 d，懸浮培養第3天時在培養基中加入SB505124(10 μmol/L)、IWP-2(10 μmol/L)和bFGF(50 ng/mL)，對擬胚體進行誘導培養，每日半量更換培養基。誘導4 d后將擬胚體轉移至普通6孔板，加入添加激素的上皮培養基(SHEM)繼續進行貼壁誘導培養，隔日更換培養基，觀察細胞形態。誘導過程見圖1。

圖1 誘導人胚胎干細胞分化為角膜上皮樣細胞方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of method used to induce human embryonic stem cells to differentiate into corneal epithelial cell

4 RT-qPCR法檢測hESCs和誘導后細胞特征性標志物mRNA表達 收集hESCs和誘導10 d、15 d和20 d的細胞，加入相應體積的Trizol裂解液提取總RNA。將RNA按照試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。8聯管中加入10 μmol/L PCR上、下游引物各0.5 μL、cDNA模板1.0 μL、Master Mix 10.0 μL和ddH2O 8.0 μL，配制成20 μL的PCR反應體系。PCR反應條件：95℃預變性2 min，后接40個循環擴增：95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min。以GAPDH作為內參，采用2?ΔΔCt法計算mRNA表達水平，其中ΔCt(待測基因mRNA)=Ct(待測基因mRNA)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(誘導后細胞待測基因mRNA)-ΔCt(ESCs待測基因mRNA)，誘導后細胞與ESCs的比值表示mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。引物由華大基因科技有限公司合成，各基因引物序列見表1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

5 免疫熒光法檢測細胞OCT4、ΔNp63及CK3蛋白表達 48孔板底部放置專用無菌細胞爬片，hESCs培養需用Matrigel包被板底。hESCs按照“2 細胞培養”中的方法培養；按照“3 細胞誘導”中的方法誘導培養；分別將ESCs和誘導第20天的細胞進行固定。用PBS沖洗3次，于4%多聚甲醛固定液中固定30 min。PBS沖洗，加入0.2%Triton X-100，室溫下透化15 min。PBS沖洗，山羊血清室溫封閉30 min。封閉液吸出，滴加待測目 標 一 抗(OCT4 1∶250、ΔNp63 1∶300、CK3 1∶50)，4℃孵育過夜。PBS沖洗，滴加相應二抗(1∶500)，避光室溫下孵育90 min，PBS沖洗。載玻片中央滴加適量封片劑(含DAPI)，將細胞爬片倒扣于載玻片封片劑上封片，倒置熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

6 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.3.0軟件對資料進行統計學分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett's檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 誘導后細胞形態與CECs相似 ESCs呈集落生長，細胞核大，常有2個或多個核仁，胞質少(圖2A)。將ESCs消化轉移至Aggrewell孔板中培養24 h，可見ESCs全部形成擬胚體，呈表面光滑的球形，密度均勻，大小均一(圖2B)。誘導第7天(即貼壁培養第3天)可見有細胞從擬胚體中爬出，排列較為有序，細胞扁平，呈三角形或短梭形，細胞核圓、居中，核較大，多為單核仁，部分可見雙核仁(圖2C)，其形態與ESCs不同，與人角膜上皮細胞形態相似。

圖2 不同階段光鏡下細胞形態(標尺=100 μm)A：ESCs；B：擬胚體；C：誘導第7天的細胞；D：誘導第10天的細胞；E：誘導第15天的細胞；F：誘導第20天的細胞Fig.2 Cell morphology images at different stages under light microscope (bar=100μm)A: ESCs; B: embryonic bodies; C: induced cells on day 7; D: induced cells on day 10; E: induced cells on day 15; F: induced cells on day 20

2 誘導后細胞表達CECs特征性標志物mRNA為檢測細胞基因表達是否發生變化，分別取ESCs和誘導10 d、15 d和20 d的細胞，用RTqPCR法檢測干性標志物OCT4和SOX2、角膜上皮祖細胞標志物ΔNp63、角膜上皮前體細胞標志物CK14、角膜上皮標志物CK3和CK12的表達。結果顯示(圖3)，相比原代ESCs，誘導后的細胞OCT4和SOX2表達明顯下調(P＜0.01)，而ΔNp63、CK14、CK3和CK12表達均逐漸上調，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 ESCs和誘導細胞相關標志物mRNA的表達(aP＜0.05，bP＜0.01，vs ESCs)Fig.3 mRNA expressions of related markers in ESCs and induced cells (aP＜0.05, bP＜0.01, vs ESCs)

3 誘導后細胞表達CECs特征性標志物蛋白 分別對ESCs和誘導20 d的細胞進行免疫熒光染色，觀察OCT4、ΔNp63和CK3的表達情況(圖4)，可以看出，ESCs高表達OCT4，不表達ΔNp63和CK3。與之相反，誘導后的細胞不再表達OCT4，開始表達ΔNp63和CK3，進一步從蛋白水平驗證了RT-qPCR的結果，說明誘導分化后的細胞為角膜上皮樣細胞。

圖4 共聚焦顯微鏡下ESCs和誘導細胞相關標志物的表達(標尺=75 μm) A：OCT4；B：ΔNp63；C：CK3Fig.4 Expressions of related markers in ESCs and induced cells under confocal microscope (bar=75 μm) A: OCT4; B: ΔNp63; C: CK3

討 論

研究顯示，體外培養的LSCs移植治療LSCD，可有效改善患者的眼表狀態，提高視力，能夠取得良好的臨床效果[3]。目前FDA批準的可用于臨床治療LSCD的細胞，來源于自體/異體角膜緣上皮細胞及自體口腔黏膜細胞。但在臨床應用中發現，口腔黏膜上皮細胞移植術后易出現持續上皮缺損，抑制角膜新生血管的能力也較差，因此LSCs是移植的最佳細胞來源。角膜緣組織及LSCs供體來源缺乏，且異體移植依賴長期的免疫抑制治療，因此，LSCs的來源對于雙眼LSCD患者仍是棘手問題。

近20年來，大量基礎研究試圖將多種來源的細胞，如角膜緣、結膜、毛囊、牙髓、骨髓間充質干細胞、口腔黏膜、鼻黏膜上皮細胞、iPSCs及hESCs等用于LSCD的眼表重建，并取得了一定的治療效果[4-5]。近年來，誘導hESCs分化為各種成體干細胞并應用于臨床治療的相關研究成為熱點。2012年，hESCs來源的視網膜色素上皮移植治療Stargardt病及干性年齡相關性黃斑變性的研究，證明了此方法的安全性。

2007年，Ahmad等[6]首次通過體外模擬LSCs微環境的方法，利用Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白、纖連蛋白及人角膜緣成纖維細胞將hESCs成功誘導為角膜上皮樣細胞，并檢測了相關標志物的表達。隨后，不同研究通過條件培養基的方法[7-8]，將人類多能干細胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)培養于角膜緣成纖維細胞或LSCs培養基[9]，或以PA6基質細胞作為飼養層細胞共培養[10]，或培養于由去上皮的角膜Bowman膜構建的組織工程材料[11]，或分步培養于不同分化培養基等[12]，也成功分化出角膜上皮細胞。但這些誘導過程多較為煩瑣，常需同時培養多種細胞，誘導周期長，成本較高。小分子化合物無動物血清，具有方便、多樣和安全等特點，可高效而精準地對特定基因進行調控，便于推廣[13]。研究表明，通過阻斷BMP信號通路，激活FGF信號通路可誘導hESCs向晶狀體祖細胞分化[14]。Src家族激酶抑制劑可通過下調經典Wnt通路，促進hPSCs向上皮分化[15]。TGF-β通路的小分子抑制劑可促進iPSCs向外胚層分化[16]。SB431542作為TGF-β通路的抑制劑，可促進hESCs向人角膜上皮前體細胞分化[13]。相比SB431542，SB505124可更高效地選擇性抑制TGF-β和激活素信號通路[17]。以上研究均說明小分子化合物在誘導多能干細胞分化方面發揮著重要作用。胚胎發育過程中，CECs來源于體表外胚層，盡管許多發育機制和信號通路尚不清楚，但阻斷TGF-β和Wnt通路在眼表/外胚層發育中是必須的[18]。IWP-2是經典Wnt信號通路的抑制劑[19]。近年來，研究多采用小分子化合物與微環境相結合的方法對hPSCs進行誘導。2014年，Mikhailova等[20]將SB505124、IWP-2和bFGF與Ⅳ型膠原蛋白聯合，成功誘導iPSCs為類角膜上皮細胞。2016年，Wang等[21]采用維甲酸、SB505124和IWP-2聯合明膠獲得ESC-CECs，并證明了其免疫原性較低。2017年，Hongisto等[22]采用SB505124、bFGF和BMP-4聯合纖連蛋白及Ⅳ型膠原蛋白誘導hPSCs分化為LSCs。本研究采用了ESCs的經典方法與小分子化合物(SB505124和IWP-2)結合，首先采用AggreWell孔板法獲得具有向內、中、外3個胚層分化潛能的擬胚體，再利用SB505124和IWP-2阻斷TGF-β和Wnt信號通路，同時聯合bFGF激活FGF通路，使細胞逐漸向著外胚層、體表外胚層及角膜上皮方向分化，成功獲得細胞形態與角膜上皮細胞相似、可表達特征性角膜上皮標志物CK3和CK12的角膜上皮樣細胞。這種方案的誘導方法較此前研究有所簡化，只用了SB505124和IWP-2兩種小分子化合物，且誘導效率不低于其他方法。后續研究我們將誘導獲得的角膜上皮樣細胞作為種子細胞，構建角膜植片，移植于堿燒傷LSCD小鼠模型進行體內實驗，對獲得的角膜上皮樣細胞功能進行進一步評價。