鮑曼不動桿菌產碳青霉烯酶對舒巴坦聯合碳青霉烯抗生素協同作用的影響

王 博，磨國鑫，周 光，王韌韜，管希周，佘丹陽

1 解放軍總醫院研究生院，北京 100853；2 解放軍總醫院第八醫學中心 呼吸與危重癥醫學部，北京100853；3 解放軍總醫院第一醫學中心 檢驗科，北京 100853

鮑曼不動桿菌是醫院感染的常見致病菌，碳青霉烯類抗生素曾是治療鮑曼不動桿菌感染最重要的抗菌藥物之一，但近年耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB)檢出率不斷上升。據2018年CHINET中國細菌耐藥監測結果，在我國臨床分離的鮑曼不動桿菌中碳青霉烯耐藥菌株的檢出率已經高達78.1%[1]。在臨床常用的抗菌藥物中，只有多黏菌素和替加環素仍對其保持了較高的體外敏感度，但這兩種體外敏感度較高的藥物在單獨用于治療CRAB感染時，療效并不能令人滿意[2]。因此聯合用藥成為治療CRAB感染的重要選擇。近年來，針對酶抑制劑舒巴坦與碳青霉烯類藥物聯合方案的體外研究屢有報道。但這種聯合方案對不同菌株的抗菌效應并不一致，對某些菌株具有明顯協同抗菌效應的聯合方案對另一些菌株卻僅表現為無關效應[3-5]。這種聯合抗菌效應的菌株間差異是否與細菌耐藥機制有關，哪些碳青霉烯耐藥菌株適合采用這種聯合治療方案，尚待闡明。本研究選取多中心教學醫院的102株CRAB菌株，檢測舒巴坦聯合碳青霉烯抗生素對這些菌株的體外抗菌活性，同時從基因水平進一步分析CRAB菌株產β-內酰胺酶的情況對舒巴坦+碳青霉烯聯合方案協同抗菌作用的影響。

資料與方法

1 菌株來源 2011 - 2014年全國13家教學醫院(解放軍總醫院、北京醫院、北京朝陽醫院、北京大學第三醫院、上海華東醫院、廣州呼吸病研究所、中國醫科大學附一院、沈陽軍區總醫院、吉林大學第二醫院、東部戰區總醫院、四川大學華西醫院、山東省立醫院、武漢同濟醫院)臨床送檢的102株CRAB菌株，所有菌株均分離自肺炎患者的下呼吸道分泌物標本。全部菌株均經VITEK-2微生物鑒定儀鑒定確認。

2 抗菌藥物體外藥敏試驗 瓊脂平板稀釋法測定亞胺培南、美羅培南、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦對102株CRAB菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。藥敏試驗的操作和敏感度折點判斷標準(頭孢哌酮舒巴坦除外)參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2017年指南[6]。藥敏試驗的質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

3 體外協同抗菌試驗計算部分抑菌濃度指數 按照棋盤法設計，采用微量肉湯稀釋法分別測定舒巴坦和亞胺培南、舒巴坦和美羅培南兩種聯合方案對102株CRAB菌株的體外協同抗菌效應[7]。MH肉湯中最終的細菌濃度為105 CFU/mL，37℃培養18～24 h后觀察結果。按照Doern[8]研究中記述的方法計算部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)并判讀結果。FICI=聯合甲藥MIC/單用甲藥MIC+聯合乙藥MIC/單用乙藥MIC，FICI指數 ≤ 0.5、0.5～1(含1)、1～4(含4)和＞4分別表示協同、相加、無關和拮抗作用。

4 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增β-內酰胺酶編碼基因和DNA測序 采用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取受試菌株的全基因組DNA。本研究中使用的β-內酰胺酶編碼基因PCR擴增引物、擴增片段長度及相應擴增條件見表1[9-11]。PCR擴增引物的合成和PCR產物的測序由TaKaRa Bio公司完成。PCR產物的測序結果在GenBank中進行序列比對分析。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences

結 果

1 6種β-內酰胺抗生素對102株鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性 102株鮑曼不動桿菌至少對1種碳青霉烯抗生素敏感度降低。其中，100株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南均耐藥，1株對亞胺培南耐藥對美羅培南呈現中介狀態(介于敏感、耐藥之間)，1株對亞胺培南敏感、對美羅培南耐藥。在4種非碳青霉烯β-內酰胺抗生素中，按照CLSI的敏感度折點判斷標準，哌拉西林他唑巴坦和氨芐西林舒巴坦的敏感度均為0，僅頭孢他啶對少數(15/102)CRAB菌株可以判斷為敏感(3株CRAB的MIC值為4 μg/mL，12株的MIC值為8 μg/mL)。6種抗菌藥物對102株鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性見表2。

表2 美羅培南等6種抗菌藥物對鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性(n=102)Tab. 2 In vitro antibacterial activity of 6 antibacterial drugs against Acinetobacter baumannii (n=102)

2 舒巴坦聯合美羅培南或亞胺培南對CRAB菌株的體外協同抗菌活性 在102株CRAB菌株中，美羅培南 + 舒巴坦、亞胺培南 + 舒巴坦兩種聯合方案協同效應的比例分別為21.57%和12.75%、相加效應的比例分別為71.57%和84.31%，無關效應的比例分別為6.86%和2.94%，在所有受試菌株中均未觀察到拮抗效應。見表3。舒巴坦 + 碳青霉烯抗生素(亞胺培南或美羅培南)總共在30株(29.41%)CRAB中觀察到了協同抗菌效應，其中有5株CRAB對舒巴坦 + 亞胺培南或美羅培南方案具有協同效應。

表3 舒巴坦分別聯合兩種碳青霉烯抗生素對102株CRAB的體外協同抗菌效應(n, %)Tab. 3 In vitro synergistic antibacterial effect of sulbactam combined with two different carbapenem antibiotics on 102 strains of CRAB (n, %)

3 CRAB菌株產β-內酰胺酶種類及其與體外協同抗菌試效應的關系 對102株CRAB的β-內酰胺酶編碼基因進行擴增及測序的結果顯示，全部CRAB菌株均產生OXA-23和OXA-51兩種碳青霉烯酶。其中，19株CRAB還同時產生OXA-58型碳青霉烯酶，13株CRAB還同時產生GES-5型碳青霉烯酶，3株CRAB同時產生OXA-23、OXA-51、OXA-58和GES-5。除碳青霉烯酶外，部分菌株還同時產生CTX-M-2、CTX-M-9和PER-1等超廣譜β-內酰胺酶，其中以CTX-M-2最為常見。在同時產生OXA-23、OXA-51和OXA-58的CRAB中，舒巴坦和碳青霉烯抗生素聯用產生協同效應的比例最高，達到了56.25%(9/16)；在僅產生OXA-23和OXA-51的CRAB中，舒巴坦和碳青霉烯抗生素聯用產生協同效應的比例為28.77%(21/73)；而在產生GES-5碳青霉烯酶的全部13株CRAB中(其中3株同時產生OXA-23、OXA-51、OXA-58和GES-5)，舒巴坦和碳青霉烯抗生素聯用均未觀察到協同效應。見表4。

表4 CRAB菌株產β-內酰胺酶種類及其與舒巴坦 + 碳青霉烯協同抗菌效應的關系Tab. 4 β-lactamases produced by CRAB strains and their relationship with the results of sulbactam + carbapenem synergistic antibacterial test

討 論

鮑曼不動桿菌的耐藥機制十分復雜，包括抗菌藥物結合位點的改變、細菌外膜蛋白缺失、外排泵亢進、產多種抗菌藥物滅活酶等[12]。其中，產生碳青霉烯酶是導致鮑曼不動桿菌對碳青霉烯抗生素耐藥的主要原因。本研究對102株CRAB的β-內酰胺酶編碼基因進行了比較全面的檢測，結果顯示全部受試菌株均攜帶blaOXA23和blaOXA-51，其中有19株同時攜帶blaOXA-58、13株同時攜帶blaGES-5。

研究顯示OXA-23 + OXA-51、OXA-23 + OXA-58和OXA-23 + OXA-58 + OXA-51是CRAB最常見的三種復合產酶模式[13-18]。鮑曼不動桿菌逐步呈現多基因聯合耐藥模式。深圳人民醫院的一項跨度為8年的研究中，臨床分離231株CRAB進行耐藥基因檢測，22株(9.52%)呈現OXA-23 +OXA-58產酶模式，4株(1.73%)呈現OXA-23 +OXA-58 + OXA-51產酶模式[19]。Qu等[7]對華西醫院2018年1-6月臨床收集的89株CRAB進行耐藥基因檢測，OXA-23 + OXA-51復合產酶模式比例高達95.53%。與以往的研究相似，本研究中CRAB主要呈現OXA-23 + OXA-51復合產酶模式，少數菌株呈現OXA-23 + OXA-58 + OXA-51、OXA-23 + OXA-51 + GES-5 ± OXA-58復合產酶模式。這可能與鮑曼不動桿菌有較強的耐藥基因獲得能力有關，菌株間具有基因互換能力、缺乏mutS基因導致基因組修復能力缺陷、含有利于從周圍環境中攝取DNA的基因等均會造成鮑曼不動桿菌復雜產酶情況[20-24]。GES-5作為由GES-1第170位甘氨酸轉變為絲氨酸衍生而來的A類碳青霉烯酶，多見于銅綠假單胞菌[25-26]，其近年來也有少量出現在鮑曼不動桿菌的報道中[27]。既往報道的鮑曼不動桿菌復合產酶模式中未見OXA23 +OXA51 + GES-5(± OXA-58)的情況。

舒巴坦是一種β-內酰胺酶抑制劑，但本身對不動桿菌也有一定的抗菌活性。2007年Lee等[28]報道聯合使用碳青霉烯和舒巴坦成功治療了4例CRAB導致的菌血癥。我們之前的研究結果也顯示，舒巴坦聯合碳青霉烯類藥物治療CRAB導致的醫院獲得性肺炎的3 d有效率和治療終點(EOT)治愈好轉率分別達到了82.35%和64.71%，歸因死亡率僅為17.65%[29]。在體外研究中，多項研究結果也顯示舒巴坦和碳青霉烯抗生素聯用對部分CRAB菌株表現出協同抗菌效應[3-5]。本研究也獲得了相似的結果。舒巴坦與碳青霉烯抗生素對CRAB產生協同抗菌效應的準確機制尚不完全清楚，推測可能與其抗菌作用靶位和酶抑制特性有關。就抗菌作用靶位而言，有研究結果顯示舒巴坦主要通過抑制青霉素結合蛋白PBP1和PBP3對鮑曼不動桿菌產生抗菌效應，而美羅培南與鮑曼不動桿菌PBP1和PBP2的親和性卻明顯強于PBP3[30]。因此，舒巴坦和碳青霉烯抗生素聯合用于治療鮑曼不動桿菌感染時，在抗菌作用靶位方面可能存在潛在互補效應。在酶抑制特性方面，盡管舒巴坦對大多數碳青霉烯酶的抑酶活性很弱或基本沒有抑酶活性，對OXA-24、OXA-40、OXA-51等碳青霉烯酶的50%抑酶濃度(50% inhibition concentration，IC50)高 達40 ～190 μmol/L[31-33]，但對OXA-58的IC50卻僅有2.5 μmol/L[34]。提示舒巴坦在較高濃度時有可能減少此類碳青霉烯酶對碳青霉烯抗生素的破壞作用。在本研究中，我們觀察到，舒巴坦和碳青霉烯抗生素聯用對三種不同碳青霉烯酶產生模式的CRAB菌株體外產生協同作用的比例有比較大差異，同時產生OXA-23、OXA-51和OXA-58的CRAB菌株產生協同效應的比例明顯高于OXA-23 +OXA-51產酶模式和OXA-23 + OXA-51 + GES-5 ±OXA-58產酶模式的菌株，而且在產GES-5型碳青霉烯酶的CRAB菌株中，舒巴坦與碳青霉烯抗生素聯合未發現體外協同效應。這一結果也間接支持舒巴坦對不同碳青霉烯酶的抑酶活性存在差異、對OXA-58有一定抑酶活性的推測。但單獨用舒巴坦對不同碳青霉烯酶的酶抑制活性差異還不能完全解釋本研究的結果，根據既往的研究結果，舒巴坦對GES-5的IC50為4.5 μmol/L[35]。提示舒巴坦對GES-5的抑制活性雖然略低于OXA-58，但卻遠高于對OXA-51等大多數碳青霉烯酶，這顯然無法解釋舒巴坦與碳青霉烯抗生素聯合在所有產GES-5型的CRAB菌株中均未發現體外協同效應這一結果。比較合理的推測是這些CRAB菌株中可能存在產生GES-5伴隨的其他非酶耐藥機制，如作用靶位改變、主動外排表達亢進、外膜通透性降低等，這有待于在今后的研究中進一步證實。此外，GES-5和OXA-58對碳青霉烯抗生素和舒巴坦的水解失活能力是否存在差異，這種差異是否會影響碳青霉烯抗生素聯合舒巴坦的協同效應，也值得深入探討。

綜上，本研究顯示，舒巴坦 + 美羅培南或舒巴坦 + 亞胺培南兩種聯合方案在體外對部分產OXA型碳青霉烯酶的CRAB產生協同抗菌效應，其 中對產 酶 模式為OXA-23 + OXA-51 + OXA-58的CRAB產生協同效應的比例超過了50%，但對產GES-5型碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌未見協同作用。舒巴坦/碳青霉烯聯用有望對部分產OXA型碳青霉烯酶的CRAB引發的感染帶來治療效益。