不同濃度七氟醚預處理對tGCI大鼠模型海馬組織神經細胞的影響

汪 靜 李文謙 曾慶繁

1）貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550001 2）貴州醫科大學附屬白云醫院，貴州 貴陽 550001

短暫性全腦缺血（transient global cerebral ischemia，tGCI）是一種起病突兀的神經內科疾病［1］，好發于中老年男性人群，且多在患者運動過量、突然起立、轉頸等時候發病。發病時長為5～20 min，可反復發展，通常24 h后可自我恢復，且無明顯后遺癥［2］。臨床尚未就tGCI 病機達成統一結論，但分析可能與以下幾點有關：（1）腦動脈粥樣硬化：腦動脈粥樣硬化通過引發腦動脈狹窄影響腦部供血，如硬化斑塊破裂，這些破裂物質將可能栓塞血管，導致小動脈梗阻，最終引發tGCI；（2）微栓塞：斑塊破裂的微小凝塊并無法直接栓塞血管，但這些凝塊將與血小板等物質結合并生成微栓子，當微栓子進入微小動脈后，將引發局部缺血現象，即tGCI；（3）心臟疾病：心房纖維顫動、左心肥厚以及心功能不全等均可能通過影響血流動力指標或介導栓子脫落參與tGCI；（4）血流動力學變化：快速起立或快速扭頭轉頸均可能導致腦血流變化，并引發tGCI，如患者已存在動脈粥樣硬化、頸動脈竇過敏，其tGCI發病率還將進一步提高［3］；（5）血液成分變化：貧血、白細胞、血小板增多癥等影響人體血液成分，導致血氧、血脂、血蛋白異常變化，影響人體血液黏度，導致血液出現病理狀態，最終參與tGCI 的發生、發展。患者臨床癥狀與其缺血的動脈系統有關，頸內動脈缺血患者癥狀以偏癱、失語、單向眼視力障礙為主；椎基底動脈缺血患者癥狀則以眩暈、站立不穩、一過性視力缺失、輕度偏癱等為主［4］。盡早恢復tGCI患者血供是本病的主要急救辦法，但也帶來新的問題，即腦缺血再灌注損傷［5］。既往研究顯示，預處理可有效提升tGCI 患者缺血耐受性，并保護患者神經［6-7］。七氟醚是一種具有缺陷耐受誘導功能的麻醉藥物，研究顯示［8］，七氟醚預處理可對tGCI 造模大鼠腦神經形成保護效應，但其最佳作用濃度及可能的作用機制臨床尚無結論。為分析tGCI 的最佳作用濃度，本文選取48 只SD 大鼠進行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組選取成年健康WKY 大鼠48只，雌雄各半，體質量240～250 g，購自于貴州醫科大學動物中心，質量合格證號：SYXK（黔）2018-0001；將SD 大鼠適應性喂養1 周，自由攝食飲水，飼養室溫度20～25 ℃，相對濕度65%～75%。將所有WKY 大鼠隨機分為模型組、2%七氟醚預處理組、4%七氟醚預處理組和6%七氟醚預處理組，每組12只。

1.2實驗方法

1.2.1 造模及處理方法：對大鼠進行水合氯醛麻醉后，于頸部設置1 cm 切口，顯露頸側總動脈，選用硅膠管包繞總動脈，并固定于硬塑圓筒上，縫合切口后，將大鼠固定在定位儀上，同時對其進行枕部行縱向1 cm切口，顯露第一頸椎及橫突板，電凝栓塞橫突板翼小孔椎動脈后縫合切口。將大鼠送回籠中，正常喂養24 h 后進行預處理，預處理10 min 后夾閉頸總動脈，大鼠30～60 s內昏迷即表明造模成功，10 min后恢復大鼠頸總動脈供血［9］。

預處理前對大鼠進行隨機分組，根據分組情況進行生理鹽水，2%、4%及6%七氟醚預處理，操作具體如下：將大鼠置于麻醉箱內，將生理鹽水或對應濃度的七氟醚與100%氧氣進行混合，并讓大鼠呼吸1 h。

1.2.2 HE染色：斷頭處死大鼠，取出海馬組織，將其固定后選用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗，并置于2%明膠內，取出后烘干并選用乙醇脫水，將樣本置于0.06%高錳酸鉀溶液內反應8 min，取出后沖洗，選用蘇木素進行染色，伊紅復染，乙醇脫水后封片，顯微鏡讀取結果。

1.2.3 神經元活力測定：選用四唑鹽比色法鑒定大鼠神經元存活情況，取2 g 海馬組織，搗碎制備為懸液，滴至48孔板內，同時每孔滴入10 μL 5 mg/mL四唑鹽磷酸緩沖液，培養箱孵化6 h后，丟棄上清液，每孔滴入80 μL DMSO溶液的深藍色結晶，混勻后反應15 min，通過酶標儀檢測OD值。

1.2.4 神經元凋亡率測定：將海馬細胞懸液置于試管內，滴入0.125%胰蛋白酶進行消化，反應5 min，1 500 r/min、5 cm 半徑離心，時間8 min，棄上清，滴入0.1 mol PBS，同前參數再次離心，將細胞濃度調整為1×106個/mL，滴入10 μL Annexin V-FITC，混勻后反應10 min，滴入5 μL PI，混勻后反應15 min，加入350 μL Annexin V Binding solution溶液，反應60 min后通過流式細胞儀讀取結果。

1.2.5 Western blot 檢測：選用0.125%胰蛋白酶對海馬細胞懸液進行消化，反應5 min 后，1 500 r/min、5 cm 半徑離心，時間8 min，滴入3 μL 細胞裂解液，于4 ℃溫度下反應20 min，隨后進行2 000 r/min、5 cm 半徑離心，時間8 min，提取總蛋白，并通過BCA法分析總蛋白濃度。將總蛋白電泳并轉膜，封閉2 h后選用Bax、LC3-Ⅱ、Bcl-2 一抗，靜置過夜，次日取出后洗滌2 次，滴入IgG 抗體進行二抗，室溫下靜置反應60 min，洗滌2次，滴入化學發光試劑，震蕩均勻反應60 s后，通過凝膠成像系統讀取結果。

1.3 統計學處理采用SPSS 22.0軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較使用F 檢驗。檢驗水準取a=0.05。

2 結果

2.1 各組海馬組織HE染色模型組海馬神經元結構及排列紊亂，細胞水腫，成片神經元系統核皺縮，七氟醚預處理組海馬結構異常情況較模型組改善，其中6%七氟醚預處理組海馬結構較清晰，排列有序，神經細胞形態較正常。見圖1。

圖1 各組海馬組織HE染色（×400，A：模型組；B：2%七氟醚預處理組；C：4%七氟醚預處理組；D：6%七氟醚預處理組）Figure 1 HE staining of hippocampus in each group（×400，A：model group；B：2% sevoflurane pretreatment group；C：4% sevoflurane pretreatment group；D：6% sevoflurane pretreatment group）

2.2 各組海馬組織神經元活力OD值比較七氟醚預處理組海馬組織神經元活力OD 值明顯高于模型組（P＜0.05），其中6%七氟醚預處理組海馬神經元活力OD 值高于2%七氟醚預處理組和4%七氟醚預處理組（P＜0.05），呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組海馬組織神經元活力OD值比較 （±s）Table 1 Comparison of OD values of hippocampal neurons in each group （±s)

表1 各組海馬組織神經元活力OD值比較 （±s）Table 1 Comparison of OD values of hippocampal neurons in each group （±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05；與2%七氟醚預處理組比較，bP＜0.05；與2%七氟醚預處理組比較，cP＜0.05

組別模型組2%七氟醚預處理組4%七氟醚預處理組6%七氟醚預處理組n F值P值12 12 12 12 OD組0.73±0.12 1.12±0.24a 1.30±0.27ab 1.55±0.26abc 24.031 0.000

2.3 各組海馬組織神經細胞凋亡率比較七氟醚預處理組海馬組織神經細胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05），其中6%七氟醚預處理組海馬神經細胞凋亡率低于2%七氟醚預處理組和4%七氟醚預處理組（P＜0.05），呈劑量依賴性。見表2、圖2。

表2 各組海馬組織神經細胞凋亡率比較 （±s）Table 2 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons in each group （±s）

表2 各組海馬組織神經細胞凋亡率比較 （±s）Table 2 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons in each group （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與2%七氟醚預處理組比較，bP＜0.05；與2%七氟醚預處理組比較，cP＜0.05

組別模型組2%七氟醚預處理組4%七氟醚預處理組6%七氟醚預處理組n F值P值12 12 12 12細胞凋亡率（%）45.51±7.36 32.21±8.11a 23.05±6.88ab 12.24±3.11abc 65.546 0.000

圖2 各組海馬海馬組織神經細胞流式細胞檢測圖（A：模型組；B：2%七氟醚預處理組；C：4%七氟醚預處理組；D：6%七氟醚預處理組）Figure 2 Flow cytometry of hippocampal neurons in each group(A：model group；B：2% sevoflurane pretreatment group；C：4% sevoflurane pretreatment group；D：6% sevoflurane pretreatment group)

2.4 各組海馬組織蛋白表達比較七氟醚預處理組海馬組織Bax 蛋白相對表達量明顯低于模型組（P＜0.05），而Bcl-2、LC3-Ⅱ相對表達量明顯高于模型組（P＜0.05）；其中6%七氟醚預處理組海馬組織Bax蛋白相對表達量低于2%七氟醚預處理組和4%七氟醚預處理組（P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達量高于2%七氟醚預處理組和4%七氟醚預處理組（P＜0.05），呈劑量依賴性；6%七氟醚預處理組海馬組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達量與2%七氟醚預處理組和4%七氟醚預處理組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

圖3 Western blot檢查圖（A：模型組；B：2%七氟醚預處理組；C：4%七氟醚預處理組；D：6%七氟醚預處理組）Figure 3 Western blot(A：model group；B：2% sevoflurane pretreatment group；C：4% sevoflurane pretreatment group；D：6% sevoflurane pretreatment group)

表3 各組海馬組織蛋白比較 （±s）Table 3 Comparison of protein in hippocampus of each group （±s）

表3 各組海馬組織蛋白比較 （±s）Table 3 Comparison of protein in hippocampus of each group （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與2%七氟醚預處理組比較，bP＜0.05；與2%七氟醚預處理組比較，cP＜0.05

組別模型組2%七氟醚預處理組4%七氟醚預處理組6%七氟醚預處理組F值P值Bcl-2相對表達量0.401±0.101 0.483±0.105a 0.514±0.100ab 0.980±0.112abc 16.654 0.000 n 12 12 12 12 Bax蛋白相對表達量0.902±0.114 0.564±0.103a 0.311±0.097ab 0.122±0.081abc 20.124 0.000 LC3-Ⅱ蛋白相對表達量0.675±0.103 0.911±0.101a 0.903±0.104a 0.901±0.108a 18.877 0.000

3 討論

海馬是多種生物的腦植物性神經功能及高級神經活動的載體，對缺血/缺氧具有較高靈敏度，是缺氧-復氧神經損傷研究工作的理想模型［10-11］。本研究中tGCI 造模后大鼠海馬神經元結構及排列紊亂，細胞水腫，成片神經元系統核出現皺縮。七氟醚則是一種麻醉誘導及蘇醒均快速平穩的吸入性麻醉藥物，既往研究顯示，預先七氟醚吸入可對大鼠腦缺血損傷形成保護效應［12］。本研究發現，給予大鼠七氟醚預處理后，其海馬結構有所改善，且6%濃度七氟醚預處理組大鼠改善情況最佳，可以發現七氟醚預處理在降低大鼠海馬神經元結構破壞上具有顯著價值，其療效與藥物濃度有關。分析其可能作用機制：七氟醚可有效降低大鼠腦代謝水平，同時抑制氧自由基表達，形成抗氧化效應［13］。七氟醚還可阻滯N-甲基-D-天冬氨酸受體劑谷氨酸介導的神經元去極化，抑制鈣質內流，進而阻滯其引發的神經元凋亡反應［14-15］。

本研究還發現，七氟醚預處理組海馬組織神經元活力OD 值明顯高于模型組，且6%七氟醚預處理組海馬神經元活力OD值最高，同時七氟醚預處理組海馬組織神經細胞凋亡率明顯低于模型組，而6%七氟醚預處理組海馬神經細胞凋亡率最低，表明6%七氟醚預處理可最大程度降低大鼠海馬神經元凋亡率，維持其活性。研究發現，開放線粒體膜內的mitoKATP路徑活化是吸入麻醉藥劑預處理措施生成心、腦保護效應的重要機制［16］。七氟醚可通過活化mitoKATP 路徑影響Bcl-2、Bax 蛋白表達，進而抑制大鼠海馬神經元的凋亡［17-18］。Bcl-2是細胞凋亡調控介質的一種，具有抗凋亡效應，Bax 則具有促凋亡效應，Bcl-2/Bax 比值直接決定了細胞的命運。當Bcl-2/Bax 比值下降，線粒體PT 路徑將被活化，大量的CytC將被釋放至細胞胞質內，最終促使細胞凋亡；Bcl-2/Bax比值上升時，細胞凋亡率將大幅降低［19-20］。本研究中七氟醚預處理組海馬組織Bax 蛋白相對表達量明顯低于模型組，而Bcl-2相對表達量明顯高于模型組，表明七氟醚預處理可通過影響Bax、Bcl-2表達水平影響大鼠海馬神經元凋亡情況。研究發現，缺氧-復氧造模大鼠七氟醚預處理后，其Bcl-2/Bax比值顯著提高，大鼠腦神經元凋亡率也隨之降低，大鼠出現缺血性腦損傷耐受［21］，與本研究結果相似。

自噬特指細胞對自身成分的消化過程，在細胞營養匱乏、血氧供給不足或出現應激狀態時，其自噬率將大幅增高［22］。LC3-Ⅱ是細胞自噬的關鍵蛋白之一，其主要表達于自噬體膜上，因此LC3-Ⅱ蛋白的高表達往往意味著細胞自噬量大幅增高［23］。本研究發現，七氟醚預處理組海馬組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達量明顯低于模型組，表明七氟醚預處理可通過調控LC3-Ⅱ表達水平來干預大鼠海馬神經細胞自噬，進而阻止其凋亡。研究表明，七氟醚預處理后大鼠海馬神經元凋亡率顯著改善，同時其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平上升［24-30］。該學者認為，七氟醚預處理后可預先啟動海馬神經元自噬，進而降低缺氧后的自噬率，增強海馬神經元對缺氧的耐受，最終降低其凋亡率。

七氟醚預處理對tGCI大鼠模型后海馬組織神經細胞有保護作用，呈劑量依賴性，6%濃度或可能是其最佳藥效濃度，而七氟醚預處理的大鼠海馬神經元保護機制可能與調控Bax、LC3-Ⅱ和Bcl-2 表達有關。