HPLC法同時檢測大鼠血漿中3種細胞色素P450探針藥物*

李天英，石 迪，鄭 巖，鄭春宇，李秋紅

（黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040）

細胞色素P450是藥物在體內代謝最重要的酶系，包括多種具有不同專屬性底物的同工酶，對許多內源性和外源性化合物的代謝起著重要作用[1]。臨床上經肝臟代謝的藥物有90%以上是由CYP450催化的，其中CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4同工酶參與代謝近60%的藥物，是藥物代謝以及毒理學研究的重要指標[2]。抑制或誘導任何一種CYP450同工酶就會改變另一種或幾種藥物的代謝特征，從而發生藥物間相互作用，尤其是通過同一種酶代謝的藥物在臨床聯合應用時，極易影響療效引起不良反應[3]。鑒于CYP450酶的活性可影響藥物代謝速率和代謝過程，國內外均把藥物對CYP450的調控作為藥物聯合應用的客觀指標和參考依據[4,5]。Cocktail探針藥物法是通過考察特異性探針藥物血藥濃度的變化，從而有效評價多種代謝酶亞型的活性，對于有多重代謝途徑的劑量設計有重要意義，被認為是一種研究藥物相互作用特殊的分析工具[6]。本實驗建立了同時測定大鼠血漿中3種同工酶探針藥物濃度的HPLC方法，為研究藥物相互作用提供有效的分析手段。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

氯唑沙宗原料藥（批號20110701，大連美侖生物技術有限公司）；甲苯磺丁脲原料藥（批號20110501，大連美侖生物技術有限公司）；咪達唑侖注射液（批號20120302，江蘇恩華藥業股份有限公司）；色譜甲醇（Dikma試劑公司）。

1.2 實驗儀器

LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津）；TDL-60B型低速臺式離心機（上海榮泰生化工程有限公司）；旋渦QT-1型混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；TCL16M型高速冷凍離心機（北京眾益中和生物技術有限公司）。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雌雄各半，體重（180±220）g，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，合格證號SCXK（黑）2008004。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Topsil TM C18column（250mm×4.6mm,5μm）；流動相為甲醇-（NH4）2HPO4（54∶46，pH值為3.4）；紫外檢測波長為230nm；流速：l.0mL·min-1；柱溫：30℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 磷酸氫二銨緩沖溶液的制備 精密稱取（NH4）2HPO42.64g，以400mL雙蒸水溶解，加85%H3PO41.4mL，調pH值至3.4。

2.2.2 內標液的配制 精密稱取地西泮10mg，用甲醇溶解并定容至10mL的量瓶中，得lmg·mL-1內標儲備液。精密移取地西泮溶液40μL，加入10mL容量瓶中，甲醇定容，得到4μg·mL-1內標液。

2.2.3 探針藥物溶液的配制 氯唑沙宗、甲苯磺丁脲以甲醇作為溶劑，咪達唑侖用水溶解，分別制備濃度為lmg·mL-1的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的儲備溶液。以水為溶劑稀釋各探針藥物的儲備液，氯唑沙宗和甲苯磺丁脲稀釋成濃度為50,20,10,2,1,0.2μg·mL-1的工作液，咪達唑侖稀釋成濃度為50,30,10,2,0.5,0.1μg·mL-1的工作液。所有溶液置4℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取200μL大鼠血漿，加入100μL濃度為4μg·mL-1地西泮溶液作為內標，混勻，再加入氯仿2mL，混懸振蕩5min，離心（3500r·min-1，10min），取有機相1.8mL，N2吹干。殘渣用流動相100μL溶解，離心（4000r·min-1，5min），取上清液，進樣20μL。

2.4 方法專屬性考察

在上述色譜條件下，按照上述方法操作。結果見圖1。圖1A為空白血漿，圖1B為含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達唑侖及地西泮對照品的空白血漿，圖1C為大鼠靜脈注射給予探針藥物后血漿樣品。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

圖1 結果表明，內源性成分對待測物和內標無干擾。

2.5 線性范圍和檢測限

分別精密量取不同濃度的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖混合工作液100μL，加入地西泮內標溶液100μL，N2下吹干，加入大鼠空白血漿200μL，使制備的血漿濃度分別為氯唑沙宗和甲苯磺丁脲50,20,10,2,1,0.2μg·mL-1；咪達唑侖50,30,10,2,0.5,0.1μg·mL-1。按2.3項下的方法處理并測定。探針藥物峰面積與內標峰面積之比Y為縱坐標，以血藥濃度X為橫坐標進行線性回歸，3種探針藥物的回歸方程見表1。線性范圍分別為：氯唑沙宗和甲苯磺丁脲0.2～50μg·mL-1；咪達唑侖0.1～50μg·mL-1，最低定量限氯唑沙宗和甲苯磺丁脲均為0.2μg·mL-1，咪達唑侖0.1μg·mL-1。

表1 血漿中各探針藥物的標準曲線數據Tab.1 Data of standard curve of probe drugs in plasma

2.6 精密度試驗

分別配制探針藥物3個濃度的標準血漿樣品，其中氯唑沙宗和甲苯磺丁脲濃度分別為1,10,20μg·mL-1，咪達唑侖濃度分別為0.5,10,30μg·mL-1，每個濃度各5份，按2.3項下方法處理并測定，于同1天內進樣5次測定，計算日內RSD；連續測定5d，求得日間RSD。結果表明精密度符合生物樣本測定要求，見表2。

2.7 回收率試驗

分別取氯唑沙宗和甲苯磺丁脲各1，10，20μg·mL-1，咪達唑侖0.5，10，30μg·mL-13種不同濃度的標準血漿樣品，各5份，按2.3項下方法處理并測定，按標準曲線計算3種探針藥物濃度，以測定值的平均值與配制的理論濃度比較，求得相對回收率。結果見表2。

表2 精密度與回收率結果（n=5）Tab.2 Precision and recovery results of probes

由表2可見，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的回收率分別在96.22%～101.42%，98.72%～104.14%，97.09%～105.27%，回收率穩定，符合生物樣本測定要求。

2.8 穩定性試驗

取空白血漿配制含3個探針藥物的低、中、高濃度的標準血漿樣品，于-20℃凍存30d，反復凍融3次，室溫放置24h，按2.3項下方法處理并測定，記錄探針藥峰面積和內標峰面積，求得樣品濃度及RSD。見表3。

表3 探針藥物穩定性考察結果（n=5）Tab.3 Stabilization determination results of probes

由表3結果可見，血漿樣品中低、中、高濃度的3探針藥物經-20℃凍存30d，反復凍融3次，室溫存放24h后，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的低、中、高濃度穩定性良好，其RSD均在10%內，符合生物樣品測定要求。

3 結論

血漿藥物濃度常用檢測方法中，高效液相色譜法（HPLC）使用較為廣泛。多種探針藥物的測定方法大多選擇HPLC梯度洗脫法，但基線不平穩，保留時間較長，操作比較復雜。因此，本實驗通過調整流動相比例及調節pH值，最終選用甲醇和（NH4）2HPO4（pH值為3.4）作為流動相，其比例在54∶46時各探針藥物和內標可分離完全，峰形良好。通過比較己烷、氯仿、二氯甲烷及苯的萃取效果，用氯仿作為萃取溶劑，內源性雜質較少，回收率和重現性均符合要求。

本研究建立的HPLC法具有選擇性強，操作簡便，靈敏度高的特點，適用于在同一色譜條件下同時測定3種CYP450亞型酶探針藥物的濃度，因而能夠同時檢測各亞型酶的活性，對于評價藥物間相互作用以及指導臨床合理用藥具有重要的意義。