薄層色譜法快速鑒別保健食品中非法添加非苯二氮?類(lèi)化合物的研究

林鳳屏，翁 嘉，李惠敏

（惠州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 惠州 516003）

非苯二氮?類(lèi)藥物（non-benzodiazepines,NBZD）是直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑，屬于第三代鎮(zhèn)靜催眠藥。該類(lèi)藥物于二十世紀(jì)八十年代末期發(fā)展迅速，主要代表藥物有唑吡坦、扎來(lái)普隆、佐匹克隆，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗驚厥、肌肉松弛等藥理作用，主要用于治療失眠[1-3]。這類(lèi)藥物對(duì)苯二氮?受體（BZ）具有特異選擇性，具有快速進(jìn)入睡眠狀態(tài)，促進(jìn)深度睡眠，正常睡眠生理結(jié)構(gòu)基本不受影響，醒后無(wú)宿醉感等特點(diǎn)。因其用量少，催眠效果好，起效快，一些不法分子在安神類(lèi)保健食品中非法添加此類(lèi)藥物。非苯二氮?類(lèi)藥物屬于第二類(lèi)精神藥物，需在醫(yī)生的指導(dǎo)下服用，濫用或長(zhǎng)期使用均會(huì)對(duì)身體造成不同程度的傷害。

目前測(cè)定非苯二氮?類(lèi)藥物一般采用高效液相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用或超高效液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[4-8]，以上方法均需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，各種實(shí)驗(yàn)耗材消耗大，檢驗(yàn)時(shí)限長(zhǎng)，不利于日常快速檢測(cè)，高效監(jiān)管。

本文探索利用薄層色譜法（TLC）對(duì)安神類(lèi)保健食品中非法添加非苯二氮?類(lèi)藥物進(jìn)行鑒別，以實(shí)現(xiàn)快速篩查，提高監(jiān)管效率，打擊不法行為。

1 材料、儀器和試藥

1.1 材料

1.1.1 樣品信息 安神類(lèi)的保健食品65批次，均由市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.1.2 對(duì)照品信息 佐匹克隆對(duì)照品（批號(hào)：100870-200801），酒石酸唑吡坦對(duì)照品（批號(hào)：171258-200601），扎來(lái)普隆對(duì)照品（批號(hào)：100670-200401）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器和試劑試藥

硅膠預(yù)制板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，型號(hào)SGF254100×100、GF25410×5，涂層厚度0.20±0.03 mm，粒度10～40 μm）；自制GF254薄層板（規(guī)格20 cm×10 cm，青島海洋化工有限公司，批號(hào)060818，涂層厚度0.5 mm）；AE-240電子分析天平：瑞士Mettler；數(shù)碼成像系統(tǒng)：瑞士CAMAG；高效液相色譜儀：Agilent 1200 Serie；1100 series/API 3000液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫/美國(guó)ABI公司；KQ-250超聲波清洗器（250 W，40 kHz）：昆山市超聲儀器有限公司。

甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 酒石酸唑吡坦、扎來(lái)普隆、佐匹克隆薄層色譜鑒別

取1片（粒）樣品的內(nèi)容物，加乙酸乙酯3 ml，振搖提取1 min使溶解，靜置，取上清為供試品溶液；同時(shí)分別取佐匹克隆、酒石酸唑吡坦、扎來(lái)普隆對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，吸取上述溶液各5～10 μl，點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（17:2:6）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，不應(yīng)顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 對(duì)照品順序 混合對(duì)照品溶液從下至上分別為：佐匹克隆、酒石酸唑吡坦、扎來(lái)普隆（見(jiàn)圖1）。

圖1 對(duì)照品順序

2.2.2 耐用性

2.2.2.1 不同薄層板的比較 取自制薄層板與市售薄層板，分別按擬定的方法試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同薄層板色譜不影響結(jié)果判斷。

2.2.2.2 不同溫度的比較 取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在2 ℃和32 ℃中展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果表明在2～32 ℃范圍內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)檢查無(wú)明顯的影響。

2.2.2.3 不同濕度的比較 取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在用硫酸調(diào)節(jié)相對(duì)濕度32 %和88 %的層析缸中展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果表明在相對(duì)濕度32 %～88 %之間試驗(yàn)，對(duì)檢查無(wú)明顯的影響。

2.2.2.4 飽和與不飽和的考察 取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在展開(kāi)前飽和10 min和立即放入展開(kāi)，取出、檢視。結(jié)果表明兩者沒(méi)有區(qū)別，所以在檢查中可不需要飽和。

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，薄層板方面自制薄層板分離效果與市售薄層板相差不大，而溫濕度變化對(duì)展開(kāi)效果影響不大，因此認(rèn)為本方法耐用性良好。

2.2.3 檢出限 取佐匹克隆對(duì)照品、酒石酸唑吡坦對(duì)照品、扎來(lái)普隆對(duì)照品分別加乙酸乙酯制成系列濃度溶液進(jìn)行試驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為1 μl。結(jié)果當(dāng)佐匹克隆對(duì)照品濃度為0.0629 mg/ml、扎來(lái)普隆對(duì)照品濃度為0.0614 mg/ml、酒石酸唑吡坦對(duì)照品濃度為0.0324 mg/ml時(shí)，對(duì)照品的熒光淬滅斑點(diǎn)仍然可見(jiàn)，故認(rèn)為方法的檢出限分別為佐匹克隆62.9 μg/ml、扎來(lái)普隆61.4 μg/ml、酒石酸唑吡坦32.4 μg/ml。

依據(jù)佐匹克隆片（膠囊）、酒石酸唑吡坦片、扎來(lái)普隆片（膠囊）的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[8]及說(shuō)明書(shū)，佐匹克隆最低臨床劑量為3.75 mg，酒石酸唑吡坦最低臨床劑量為5 mg，扎來(lái)普隆最低臨床劑量為5 mg。由表1可見(jiàn)，本方法的檢出限低于最低臨床劑量的十分之一，故認(rèn)為對(duì)于非法添加上述3種成分，均可檢出，且鑒別快速。

表1 佐匹克隆、扎來(lái)普隆、酒石酸唑吡坦的檢出限與最低臨床劑量

2.2.4 不同點(diǎn)樣量 取佐匹克隆、酒石酸唑吡坦、扎來(lái)普隆3種對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 ml分別含1，0.2，1 mg的混合溶液，分別吸取上述對(duì)照品溶液2～14 μl點(diǎn)于同一薄層色譜板上，按擬定的方法展開(kāi)、檢視。結(jié)果4 μl點(diǎn)樣量所顯斑點(diǎn)可見(jiàn)，而6 μl點(diǎn)樣量所顯斑點(diǎn)清晰，能滿(mǎn)足觀察需要。考慮到不同樣品添加的量不一致，視樣品情況選擇5～10 μl作為薄層色譜檢查的點(diǎn)樣量。

3 結(jié)果與分析

3.1 薄層色譜結(jié)果

65批次樣品經(jīng)2.1項(xiàng)方法處理，展開(kāi)，顯色后，結(jié)果呈陽(yáng)性的有4批次樣品，懷疑添加佐匹克隆化學(xué)成分（見(jiàn)圖2）。

圖2 陽(yáng)性樣品圖譜

3.2 高效液相色譜（HPLC-DAD）結(jié)果

65批次樣品經(jīng)高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果有4批次樣品的供試品色譜中，顯與佐匹克隆保留時(shí)間相同的色譜峰，采用二極管陣列檢測(cè)器比較相應(yīng)色譜峰的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，結(jié)果吸收光譜與佐匹克隆一致。高效液相色譜法與薄層色譜法檢測(cè)結(jié)果一致。

3.3 液質(zhì)聯(lián)用儀分析結(jié)果

4批次初篩呈陽(yáng)性的樣品采用液質(zhì)聯(lián)用儀分析方法進(jìn)行分析，結(jié)果所得的質(zhì)譜圖與佐匹克隆對(duì)照溶液的質(zhì)譜圖一致，高效液相色譜法所確認(rèn)的添加成分與質(zhì)譜結(jié)果一致。

4 討論

通過(guò)薄層色譜法，對(duì)市售的65批次安神類(lèi)保健食品進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)4批次樣品添加了佐匹克隆，檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)果一致。佐匹克隆為處方藥，必須在醫(yī)生指導(dǎo)下服用，佐匹克隆所致不良反應(yīng)，包括味覺(jué)障礙、譫妄、昏迷、嚴(yán)重激越、記憶損害、睡行癥、呼吸抑制、急性胰腺炎、急性間質(zhì)性腎炎、戒斷癥狀、過(guò)敏反應(yīng)等[9-11]，由于保健食品中非法添加的藥物劑量不明確，具有很大的潛在危險(xiǎn)。

對(duì)于懷疑添加非苯二氮?類(lèi)化合物的樣品，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，既可節(jié)約時(shí)間、成本，又能準(zhǔn)確快速篩查出陽(yáng)性樣品，在打擊藥品、保健食品違法添加化學(xué)成分不法行為中有廣闊的應(yīng)用前景。