HPLC測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方食品中羅漢果甜苷V含量

柳 俊，李漢西，黃琪評(píng)，曾德猷，盧韻君

（廣州紐健生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品（簡(jiǎn)稱(chēng)：特醫(yī)食品），根據(jù)我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的定義，這類(lèi)食品是“為了滿(mǎn)足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專(zhuān)門(mén)加工配制而成的配方食品。該類(lèi)產(chǎn)品必須在醫(yī)生或臨床營(yíng)養(yǎng)師指導(dǎo)下單獨(dú)食用或與其他食品配合食用”。

特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方食品主要含有碳水化合物及鈉、鉀、鎂、磷等電解質(zhì)，其蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維的含量為零，主要用于臨床手術(shù)患者術(shù)前飲用。患者術(shù)前口服電解質(zhì)配方食品可減輕圍手術(shù)期胰島素抵抗和不適癥狀，如饑餓、口渴、惡心或焦慮，縮短住院時(shí)間[1]。由于其含有豐富的電解質(zhì)，臨床上很多術(shù)前患者反饋產(chǎn)品口感不佳，因此，為改善產(chǎn)品口感，增強(qiáng)患者服用依從性，故在配方中添加純天然植物代糖羅漢果甜苷。一方面，羅漢果甜苷的甜味持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、后味持久，可明顯改善產(chǎn)品口感，另一方面，羅漢果甜苷為純天然植物代糖，安全無(wú)毒，且不存在糖代謝負(fù)擔(dān)[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品添加劑羅漢果甜苷的檢測(cè)，主要涉及原料、普通食品及藥品，尚未見(jiàn)有特醫(yī)食品中羅漢果甜苷含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。為了更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)建立測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方中羅漢果甜苷含量的HPLC方法。該法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于該類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料

羅漢果甜苷V標(biāo)準(zhǔn)品（來(lái)源：Stanford Analytical Chenicals Inc，批號(hào)：88901-36-4）；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，蒸餾水為雙蒸水；特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方食品（廣州紐健生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器

UltiMate3000系列高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific，紫外檢測(cè)器，工作站Chromeleon 7）；BSA223S電子分析天平（Sartorius）；UV-250分光光度計(jì)（日本島津）；SB25-12DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜測(cè)定條件 Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 %磷酸溶液:乙腈（76:24）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)；203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取羅漢果甜苷V對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置入10 ml量瓶，用70 %乙腈溶解并定容。

1.3.3 供試品溶液的制備 稱(chēng)取供試品約1 g，精密稱(chēng)重，置入10 ml量瓶，加70 %乙腈8 ml，加塞，超聲處理20 min，放冷，用70 %乙腈定容至10 ml，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。臨用前，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.4 陰性供試品溶液的制備 參照產(chǎn)品工藝過(guò)程制備缺羅漢果甜苷的陰性產(chǎn)品，照“1.3.3”項(xiàng)下制備缺羅漢果甜苷陰性供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜測(cè)定方法的選擇

取羅漢果甜苷V對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，羅漢果甜苷V在波長(zhǎng)203 nm處有強(qiáng)吸收峰，因此選定203 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研[3-9]及試驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)多種流動(dòng)相條件進(jìn)行對(duì)比，最后選定用0.1 %磷酸溶液:乙腈=76:24為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min。

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

陰性供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在羅漢果甜苷相同的保留時(shí)間處基本無(wú)色譜峰，說(shuō)明陰性制劑對(duì)所測(cè)組分無(wú)干擾。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1 ～圖3。

圖1 羅漢果甜苷V對(duì)照品色譜圖

圖3 陰性供試品色譜圖

2.3 線(xiàn)性試驗(yàn)

分別精密吸取不同濃度羅漢果甜苷V對(duì)照品溶液（每1 ml中含羅漢果甜苷V分別為0.005，0.01，0.015，0.02，0.04，0.05，0.08，0.1 mg）10 μl進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積（Y）對(duì)羅漢果甜苷V含量（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=39.5494X+0.0108r=0.9997。表明羅漢果甜苷V在含量0.05 ～1.0 μg范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μl重復(fù)進(jìn)樣8次，測(cè)得峰面積積分值RSD為0.93 %，表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的供試品，按“1.3.3”項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，按色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，羅漢果甜苷平均含量為每100 g含25.201 mg，RSD為3.29 %。表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液10 μl，分別于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，21和24 h按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得峰面積積分值RSD為1.10 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的供試品約1 g，共9份，分別精密加入一定量的羅漢果甜苷V對(duì)照品（1 ～3號(hào)樣品按樣品中羅漢果甜苷含量的80 %添加，4 ～6號(hào)樣品按樣品中羅漢果甜苷含量的100 %添加，7 ～9號(hào)樣品按樣品中羅漢果甜苷含量的120 %添加），按“1.3.3”項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法處理，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，回收率在95 %～105 %區(qū)間，RSD為1.59 %，表明方法回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

本試驗(yàn)考察波長(zhǎng)、流速、溫度、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相磷酸溶液濃度發(fā)生微小變化時(shí)對(duì)本品含量測(cè)定的影響程度。

波長(zhǎng)：考察201和205nm檢測(cè)波長(zhǎng)變化對(duì)羅漢果甜苷含量檢測(cè)的影響程度。

流速：考察0.8和1.2 ml/min流速對(duì)羅漢果甜苷含量檢測(cè)的影響程度。

溫度：考察28和32 ℃溫度對(duì)羅漢果甜苷含量檢測(cè)的影響程度。

流動(dòng)相比例變化：考察0.1 %磷酸溶液:乙腈為74:26，78:22流動(dòng)相比例對(duì)羅漢果甜苷含量檢測(cè)的影響程度。

流動(dòng)相：0.08 %和0.12 %磷酸溶液對(duì)羅漢果甜苷含量檢測(cè)的影響程度。

結(jié)果表明，不同色譜條件下，羅漢果甜苷含量檢測(cè)值RSD為4.11 %，表明當(dāng)色譜條件發(fā)生微小變化后，對(duì)本品含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。因此，認(rèn)為本方法耐用性良好，滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。

3 討論

試驗(yàn)對(duì)供試品中羅漢果甜苷提取的影響因素進(jìn)行了考察，分別采用水、50 %甲醇溶液、50 %乙腈溶液、70 %甲醇溶液、70 %乙腈溶液為提取溶劑，超聲10，20，30和40 min，結(jié)果表明70 %乙腈溶液作為提取溶劑，超聲20 min時(shí)提取率最高。

特醫(yī)食品作為臨床患者首選的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，通常服用量較大且服用時(shí)間較長(zhǎng)，因此，產(chǎn)品的安全性顯得尤為重要。本研究特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方食品中甜味劑選用純天然甜味劑羅漢甜苷，其甜度和安全性均較高[10]，在改善口感的同時(shí)也能有效降低甜味劑給臨床患者帶來(lái)的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2014）中特殊膳食用食品中可以使用的甜味劑除了羅漢果甜苷外，還有乳糖醇、赤蘚糖醇和木糖醇，這些糖醇雖然安全性較高，但是甜度較低，配方用量較羅漢果甜苷相比大1 ～2個(gè)數(shù)量級(jí)，不符合特醫(yī)食品的配方設(shè)計(jì)原理。

本研究采取HPLC法測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方食品中羅漢果甜苷的含量，主要目的是通過(guò)測(cè)定產(chǎn)品中羅漢果甜苷分布情況判定產(chǎn)品中各營(yíng)養(yǎng)成分的混合均一性。作為甜味劑，通常羅漢果甜苷是配方中最小組分，其分布的均勻性能很好地代表混合體系的均勻性，參照美國(guó)FDA《混合均勻性取樣和評(píng)價(jià)指南》的規(guī)定，不同位點(diǎn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)RSD在5 %以?xún)?nèi)，表明混合均勻[11]。這也是本研究的主要意義之一。

本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途電解質(zhì)配方食品中羅漢果甜苷的測(cè)定，由于特醫(yī)食品中電解質(zhì)配方、增稠組件和碳水化合物組件的配方類(lèi)似，因此，本研究對(duì)于以上3類(lèi)特醫(yī)食品中羅漢果甜苷的測(cè)定具有一定的適用性，至于其他類(lèi)別的特醫(yī)食品，還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。