LC-MS/MS法測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉及其毒代動力學研究

王 芳，徐玲玲，劉愛明，逯海燕，劉小雨，陳 凱

（山東省藥學科學院、山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

中藥丹參中提取的丹參酮IIA具有改善心肌供血、保護心肌細胞、抗炎及抗氧化的藥理作用，可用于治療冠心病、腦卒中、心絞痛、急性心肌梗死等疾病，是臨床上治療心腦血管疾病的常用藥[1-3]。但是丹參酮IIA因為水溶性差，胃腸道難吸收故而臨床起效慢，后經磺化成鹽合成丹參酮IIA磺酸鈉，制成注射劑，解決了上述問題[4-7]。

近年對丹參酮IIA磺酸鈉的研究較多[8-11]，多采用高效液相色譜法測定其制劑含量及藥代動力學方面，目前尚未見報道LC-MS/MS方法測定其含量及相關的毒代動力學研究資料。本研究擬建立一種LC-MS/MS方法測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉的濃度，并將其應用于注射用丹參酮IIA磺酸鈉的毒代動力學研究，預測其在臨床長期應用時的潛在風險。

1 材料

1.1 試劑

乙腈（色譜純，批號：155174，Fisher scientific）；水（Advantage A10 Milli-Q超純水機制備）；氯唑沙宗（批號：100364-201302，中國食品藥品檢定研究院）；丹參酮IIA磺酸鈉（含量：99.1 %，自制），注射用丹參酮IIA磺酸鈉（含量：98.9 %，自制）。

1.2 儀器

Agilent 1260-6430三重四極桿串聯質譜儀（安捷倫科技有限公司）。AUW-120D型電子分析天平（島津公司）；Eppendorf移液器（艾本德公司）；Advantage A10 Milli-Q超純水機（默克化工技術有限公司）；Vortex Genius 3渦旋儀（廣州儀科實驗技術有限公司）；Z216MK 高速冷凍離心機（Hermle有限公司）。

1.3 試驗動物

大鼠30只，體重170 ～220 g，年齡約6 ～8周，購買自北京維通利華實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]。

1.4 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），GL Sciences；流動相為水（A）與乙腈（B）；洗脫梯度為0～3 min，15 % B→95 % B；3～3.5 min，95 % B，3.5～3.51 min，95 % B→15 %B；3.51～5 min，15 % B；流速1.3 ml/min，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μl，進樣器溫度8 ℃，分析時間為5 min，柱后采用1:4三通分流。

1.5 質譜條件

離子化方式：電噴霧-負離子；干燥氣：N2；干燥氣流速10 L/min，干燥氣壓力40 psi，干燥氣溫度350 ℃，毛細管電壓4000 V。監測方式：MRM，丹參酮IIA磺酸鈉定量離子對為m/z：373.1→357.0，內標氯唑沙宗定量離子對為m/z：168.0→132.0。

1.6 溶液配制

精密稱取丹參酮IIA磺酸鈉10 mg置入10 ml量瓶，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，配成質量濃度為1 mg/ml儲備液。平行配制2份，兩份儲備液分別用乙腈稀釋成為1，2.5，5，10，25，50，75，100 μg/ml標準曲線溶液及1，2，40和80 μg/ml質控溶液。儲存于2～8 ℃冰箱。

精密稱取10 mg氯唑沙宗置入100 ml量瓶，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，配成濃度為100 μg/ml內標儲備液。移取1 ml置入1 L量瓶，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，配成濃度為100 ng/ml內標溶液。

1.7 樣品處理

吸取“1.8”項采集的血漿樣本20 μl，加入含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液580 μl，渦旋2 min混勻，13000 r/min離心5 min，取上清100 μl，水100 μl置于96孔板中渦旋10 min混勻后，進樣檢測。

1.8 毒代動力學

大鼠隨機分成3組，每組10只，雌雄各半，低、中、高劑量組給藥劑量分別10，20，40 mg/kg，給藥方式為靜脈推注，給藥體積均為10 ml/（kg·d）-1，連續4周每天給藥1次。采血日期為D1和D28，采血時間點：給藥前（0 h）及給藥后5，15，30 min及1，2，4，8，12 h。頸靜脈取血0.2 ml，置入預涂肝素鈉的離心管，8000 r/min離心5 min，取上層血漿，-65 ～-85 ℃保存。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 專屬性 分別取6個不同個體大鼠空白血漿，按“1.7”項操作（含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液改為純乙腈），經分析，得空白血漿色譜圖（見圖1A）；將含250 ng/ml丹參酮IIA磺酸鈉的血漿樣本，依照“1.7”項操作（含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液改為純乙腈），經分析，得丹參酮IIA磺酸鈉色譜圖（見圖1B）；將空白血漿，依照“1.7”項操作，經分析，得內標色譜圖（見圖1C）；取給藥后2 h的血漿樣品20 μl，按“1.7”項操作，得血漿樣品色譜圖（見圖1D）。6個不同個體空白基質在丹參酮IIA磺酸鈉出峰位置均無響應，不干擾其定量。

圖1 丹參酮IIA磺酸鈉及內標代表性色譜圖

2.1.2 殘留 在標準曲線最高濃度樣品（ULOQ）后，進樣空白大鼠血漿樣品，考察殘留。ULOQ樣品后進樣的空白大鼠血漿樣品中在丹參酮IIA磺酸鈉出峰位置無響應，說明殘留對丹參酮IIA磺酸鈉準確定量無干擾。

2.1.3 標準曲線和定量下限 取標準曲線溶液，按照1:9比例，用空白大鼠血漿稀釋得到100，250，500，1000，2500，5000，7500，10000 ng/ml血漿樣本，按“1.7”項操作。以丹參酮IIA磺酸鈉的濃度為橫坐標（x），丹參酮IIA磺酸鈉與內標氯唑沙宗的峰面積比值為縱坐標（y），用加權最小二乘法（權重為1/x2）進行回歸運算。回歸方程為y=0.044 457x+0.087 889，r=0.9932，表明丹參酮IIA磺酸鈉在100 ～10000 ng/ml范圍內線性關系良好。

取濃度為100 ng/ml血漿樣本，按“1.7”項操作，平行測定6個樣本。結果準確度為99.2 %，精密度用RSD表示為9.0 %，符合生物樣本的檢測要求。

2.1.4 準確度與精密度 用空白血漿將丹參酮IIA磺酸鈉質控溶液稀釋成定量下限（100 ng/ml）、低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）4個濃度的樣本，按“1.7”項下依法操作，每一濃度6個平行樣本，3個分析批分3天進行，以標準曲線算得待測分析物的濃度，并計算樣本的批內、批間準確度和精密度。結果見表1，批內和批間準確度85 %～115 % ，精密度RSD不超過15 %。

表1 丹參酮IIA磺酸鈉的批內、批間準確度與精密度

2.1.5 基質效應與回收率 為考察大鼠血漿中復雜基質對檢測結果的影響，使用6批來自不同個體的提取后的空白大鼠血漿溶液稀釋質控樣本溶液至低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）得到含基質樣本，使用乙腈稀釋質控樣本溶液至低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）得到純溶液樣本，通過計算計算經內標歸一化的基質因子考察基質效應。比較準確度與精密度項下低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）血漿樣本與純溶液樣本的峰面積考察回收率。結果見表2。

表2 基質效應與回收率

2.1.6 穩定性考察 用空白大鼠血漿將質控溶液稀釋成低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3個濃度的樣本，每個濃度6份。分別考察丹參酮IIA磺酸鈉血漿樣品室溫放置5 h，-10～-30 ℃放置15 d、樣品處理后進樣器內8 ℃放置30 h及4個冷凍-解凍周期的穩定性。結果見表3，丹參酮IIA磺酸鈉血漿樣品在上述儲存條件下均穩定。

表3 丹參酮IIA磺酸鈉在不同條件下穩定性（n=6）

2.1.7 稀釋可靠性 取1 mg/ml丹參酮IIA磺酸鈉儲備液用乙腈稀釋至800 μg/ml，取20 μl，加入180 μl大鼠空白血漿，渦旋混勻，得80 μg/ml血漿樣本。取10 μl該樣本加大鼠空白血漿190 μl渦旋混勻稀釋，平行6份，按“1.7”項操作。稀釋20倍后，測量結果準確度為107.9 %，RSD為2.6 %，表明稀釋20倍可靠。

2.2 毒代動力學

采用驗證的LC-MS/MS法測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉的濃度，以隨行標準曲線計算血漿藥物濃度，采用WinNonlin 6.3軟件非房室模型計算主要毒代動力學參數Cmax、AUC0-t。結果見表4和圖2。

圖2 首次（A）、末次（B）給藥后各組丹參酮IIA磺酸鈉的平均血藥濃度-時間曲線

表4 丹參酮IIA磺酸鈉在大鼠體內的毒代動力學參數

3 討論

注射用丹 參酮IIA磺酸鈉在大鼠體內的毒代動力學研究尚未見報道，本研究建立了測定大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉濃度的LC-MS/MS分析方法，該法重現性好、靈敏度高、簡單快速，適用于檢測大鼠血漿中丹參酮IIA磺酸鈉的濃度。在方法開發過程中發現，進樣溶劑組成對峰型有較大影響，故

采用有機溶劑蛋白沉淀后取上清加入等比例水，改善峰型。本試驗在色譜柱后采用1:4三通分流減少進入質譜的流動相與不分流相比，樣本響應重現性得到很大提升。

大鼠一日1次、連續28 d靜脈注射丹參酮IIA磺酸鈉，連續28天給藥后，各劑量組雌雄大鼠體內丹參酮IIA磺酸鈉暴露量較首次給藥無明顯升高，表明藥物無蓄積；毒理學結果表明，除40 mg/kg組大鼠藥后可見與受試物顏色相關的橙色尿液及稀便外，動物的體重、攝食量、臨床病理學及組織病理學檢查指標均未見異常改變，其最大未觀察到損害作用劑量（NOAEL）為40 mg/kg。

綜上所述，本研究開發的 LC-MS/MS 法符合生物樣品分析的要求，可用于注射用丹參酮IIA磺酸鈉毒代動力學研究，通過觀察重復給予受試物后大鼠體內暴露量與給藥劑量和時間關系，預測受試物在應用時的潛在風險，為其臨床前研究奠定了基礎[11-13]。