超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中三氯生和三氯卡班

范晨麗，李彥超，申二永

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450008）

三氯生（triclosan，TCS）和三氯卡班（triclocarban，TCC）作為高效、安全的新型抗菌劑[1]，在日化產(chǎn)品[2]、洗滌劑、醫(yī)療消毒和衛(wèi)生保健產(chǎn)品[3-5]中應(yīng)用廣泛。國內(nèi)關(guān)于三氯生對人體是否存在致癌性仍有爭議，尚無足夠證據(jù)證實(shí)其對人體的致癌性，Zeng等[6]指出三氯生能誘導(dǎo)小鼠肝硬化，有肝腫瘤促進(jìn)劑的作用和肝毒性效應(yīng)，且與含氯的自來水發(fā)生反應(yīng)形成氯仿。三氯卡班能引起人體肝細(xì)胞DNA 損傷[7]，是種新型的內(nèi)分泌干擾素[8]。

目前，化妝品中三氯生和三氯卡班的檢測方法為高效液相色譜法[9-10]，氣相色譜法[11]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]等；氣相和氣相-質(zhì)譜聯(lián)用操作繁瑣，高效液相色譜法是目前最廣泛采用的方法。但化妝品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，易造成假陽性結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)日益增強(qiáng)，專屬性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)多種組分結(jié)構(gòu)確認(rèn)，大大提高待測化合物篩查的準(zhǔn)確度。

本研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[15]里針對于三氯卡班的第一方法為液相色譜法，而三氯生未被納入規(guī)范。一些檢測機(jī)構(gòu)采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1786-2006（進(jìn)出口化妝品中三氯生和三氯卡班的測定）中液相色譜法進(jìn)行檢測。少有文獻(xiàn)研究化妝品中用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定三氯生和三氯卡班的方法。本文在優(yōu)化前處理的基礎(chǔ)上，基于超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了高靈敏度、易操作的化妝品中三氯生和三氯卡班的分析方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（ESI 源）（美國Waters 公司）；KQ5200DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；IKAMS3 basic旋混合器（上海珂淮儀器有限公司）；XP-105型分析天平（梅特勒-托利多公司）；3-30K型離心機(jī)（德國Sigma公司）；MILLI-Q Advantage型純水機(jī)（法國默克密理博公司）。

1.2 材料

1.2.1 對照品和試劑 三氯生（批號TC190617-02，Stanford Chemicals，純度99.8 %）；三氯卡班（批號TC180821-10，Stanford Chemicals，純度99.8 %）；試劑：甲醇（色譜純，德國默克）； 超純水（自制）。

1.2.2 實(shí)際樣品 樣品均采購自鄭州某大型超市：防曬類化妝品9批 ，均乳狀；祛痘類9批（其中3批3水基狀、3批乳狀、3批霜狀 ）嬰幼兒類8批（其中4批乳狀、4批霜狀） 沐浴類4批 （其中2批乳狀、2批水基狀）；陰性樣品（即經(jīng)檢測不含三氯生和三氯卡班的嬰幼兒類乳狀樣品）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以水為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量2 μl。詳見表1。

表1 高效液相色譜流動相及參考分離條件

2.1.2 質(zhì)譜條件 電離方式為ESI（-）；毛細(xì)管電壓2.5 kV；離子源溫度 150 ℃；脫溶劑氣溫度 300 ℃；脫溶劑氣流量 600 L/hr；碰撞氣為氬氣；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。三氯生和三氯卡班的質(zhì)譜測定參數(shù)見表2。

表2 三氯生和三氯卡班的質(zhì)譜測定參數(shù)

2.1.3 液態(tài)水基類、膏霜乳液類樣品前處理 準(zhǔn)確稱取樣品約0.5 g（精確至0.0001 g）置入25 ml具塞比色管，甲醇定容至刻度，超聲振蕩20～30 min使樣品完全分散（如有無法分散的樣品可50～60 ℃水浴約2～3 min即可溶解）。6000 r/min離心10 min。如需稀釋，則取上清用甲醇適當(dāng)稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至棕色（防止見光分解）進(jìn)樣瓶中作為待測溶液。

2.1.4 固體皂類樣品前處理 從中切開樣品，刮取斷面樣品（碎末狀），準(zhǔn)確稱取約0.5 g（精確至0.0001 g）置入25 ml具塞比色管，先加入丙酮10 ml，渦旋2 min，使樣品完全分散（如有無法分散的樣品需50～60 ℃水浴約2～3 min即可溶解）。超聲振蕩20～30 min后，用甲醇定容至刻度，于6000 r/min離心10 min。如需稀釋，則取上清用甲醇適當(dāng)稀釋， 0.22 μm濾膜過濾至棕色進(jìn)樣瓶中作為待測溶液。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取三氯生和三氯卡班對照品各10 mg分別置入10 ml量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取上述各溶液適量置入10 ml量瓶，用甲酸稀釋，配制三氯生濃度為1 μg/ml 、三氯卡班濃度為10 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃冷凍條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確稱取陰性樣品0.5 g（精確至0.001 g），精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 ml，按照樣品前處理方法得三氯生濃度為100 ng/ml和三氯卡班濃度為1 μg/ml基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再經(jīng)適當(dāng)甲醇稀釋，獲得三氯生和三氯卡班的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其質(zhì)量濃度分別為5，10，50，100，200，400，500 ng/ml和0.5，1，5，10，20，40，50 ng/ml。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

2.2 結(jié)果

2.2.1 樣品前處理的優(yōu)化 針對液態(tài)水基類、膏霜乳液類樣品，前處理分別用甲醇、乙腈，甲醇-水（7:2）和乙腈-水（7:2）4種有機(jī)溶劑提取。結(jié)果表明，甲醇和甲醇-水（7:2）對樣品基質(zhì)的干擾小，且甲醇的回收率略高于甲醇-水（7:2）；而乙腈和乙腈-水（7:2）致使膏霜類的三氯卡班回收率略低。針對于固體皂類樣品，因水溶性差、提取率低，處理樣品前需用極性強(qiáng)的溶劑先溶解分散樣品。于是分別選用四氫呋喃和丙酮先溶解分散樣品，再用甲醇定容。結(jié)果表明，四氫呋喃處理的回收率略低于丙酮，且四氫呋喃有毒性，對儀器有腐蝕性。綜上，本實(shí)驗(yàn)選中甲醇作為液態(tài)水基類、膏霜乳液類樣品的提取溶劑，丙酮作為固體皂類樣品前處理溶劑。

2.2.2 液質(zhì)條件的優(yōu)化 采用正離子ESI（+）掃描模式和負(fù)離子ESI（-）掃描模式對三氯生和三氯卡班進(jìn)行掃描，兩者均在負(fù)離子ESI（-）掃描模式下響應(yīng)度高，0.3 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)混合溶液以20 μl/min的流速直接注入，在全掃描的方式下確定三氯生和三氯卡班的母離子，優(yōu)化錐孔電壓、毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣流量等質(zhì)譜參數(shù)，使母離子響應(yīng)值最高。再用子離子模式確定各自的子離子，優(yōu)化碰撞能量，使子離子的響應(yīng)度達(dá)到最大，從而確定最優(yōu)的質(zhì)譜條件。響應(yīng)度較高的兩子離子，一個為定性離子，一個為定量離子。由于三氯生含有氯分子結(jié)構(gòu)，通過全掃描分別有286.855和288.855為母離子。在子離子掃描時286.855和288.855的質(zhì)量數(shù)35.0的響應(yīng)度遠(yuǎn)高于以286.855為母離子、141.912和159.987為子離子的兩組離子對的響應(yīng)度。結(jié)果表明，三氯生的定性離子m/z288.855>34.989、定量離子m/z286.855>34.989；三氯卡班的定性離子m/z312.882>125.956、定量離子m/z312.882>159.85。

2.2.3 液相條件的優(yōu)化 由于乙腈洗脫能力強(qiáng)，基線分離較困難，因此分別以甲醇-水、甲醇-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %乙酸溶液、甲醇-0.05 mol/L甲酸銨溶液、甲醇-0.05 mol/L乙酸銨溶液為流動相，對三氯生和三氯卡班進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，三氯生和三氯卡班在負(fù)離子模式的響應(yīng)度較高，甲醇-0.1 %甲酸溶液和甲醇-0.1 %乙酸溶液作為流動相在負(fù)離子模式下，甲酸和乙酸會抑制峰強(qiáng)度，響應(yīng)度低且容易拖尾；甲醇-0.05 mol/L甲酸銨溶液和甲醇-0.05 mol/L乙酸銨溶液作為流動相雖有利于化合物電離，響應(yīng)度增加，但銨鹽需要大量沖洗柱子，耗時。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇和水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，有利于目標(biāo)物的洗脫，節(jié)約時間，可有效地滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.4 方法的線性關(guān)系和定量限 將不同質(zhì)量濃度的三氯生和三氯卡班的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，兩者分別在5 ～500，0.5 ～50 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996。按照信噪比為S/N≥10計(jì)算定量限，三氯生和三氯卡班的定量限分別為0.5，0.01 μg/g。結(jié)果見表3。

圖1 三氯生和三氯卡班混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖

表3 三氯生和三氯卡班的線性范圍和定量線

2.2.5 精密度和回收率試驗(yàn) 采用陰性樣品分別加入三氯生和三氯卡班的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制成含三氯生加標(biāo)水平為25，100，250 μg/g加標(biāo)樣品，含三氯卡班加標(biāo)水平為 2.5，10，25 μg/g加標(biāo)樣品。每個濃度進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。結(jié)果表明，三氯生的回收率在96.8 % ～100.3 %之間、三氯卡班的回收率在92.8 % ～110.2 %之間。三氯生RSD在2.3 % ～8.8 %之間、三氯卡班的RSD在1.7 % ～4.5 %之間，三氯生和三氯卡班的精密度和回收率良好。見表4。

表4 三氯生和三氯卡班回收率（n=6）

2.2.6 實(shí)際樣品的測定 按本文建立的方法對作者單位承擔(dān)的30批檢品進(jìn)行了三氯生和三氯卡班的檢測。結(jié)果表明，祛痘類檢出三氯生1批；防曬類檢出三氯生 1批；沐浴類和嬰幼兒類未檢出三氯卡班和三氯卡班。與樣品標(biāo)簽標(biāo)識成份完全吻合，其含量值均未超過我國規(guī)定的限值。表明此法能適用不同基質(zhì)的化妝品檢測。

3 討論

考慮三氯生和三氯卡班有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，國內(nèi)外對兩者都做出嚴(yán)格的規(guī)定。 FDA出臺相關(guān)禁令：規(guī)定沐浴露中禁止添加三氯生和三氯卡班；國內(nèi)對三氯生和三氯卡班尚未出臺相關(guān)禁令，相關(guān)產(chǎn)品仍正常銷售，尤其國內(nèi)知名品牌。但在2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定，三氯生和三氯卡班的最大濃度不得超過0.2 %。

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中三氯生和三氯卡班的測定方法。分析速度快、精密度高，回收率高，避免假陽性，能滿足實(shí)際工作中對化妝品中三氯生和三氯卡班的檢測。