核磁共振定量技術測定原薯蕷皂苷對照品的含量

韓 君，林 帥

（1.北京康仁堂藥業有限公司 中藥配方顆粒關鍵技術國家地方聯合工程研究中心，北京 101301；2.康龍化成（北京）新藥技術股份有限公司，北京 100176）

原薯蕷皂苷（protodioscin），分子式為C51H84O22，屬于甾體皂苷，又名呋喃固醇皂苷，有多種藥理作用，如增強性功能、降血脂作用、對癌細胞的毒殺作用和抗白血病作用[1]。原薯蕷皂苷為穿山龍主要生物活性成分，由于其在中藥提取過程中易發生轉化反應[2]且分離純化中易存有雜質[1]，且原薯蕷皂苷極具吸濕性，在應用常規的含量測定方法，如高效液相色譜法[3]、液質聯用法[4]等進行測定時，其結構不穩定，結構紫外吸收較弱，易受雜質干擾等造成含量測定不準確[5]，且耗費大量人力物力。因此，有必要探索新的技術與方法對原薯蕷皂苷的含量進行測定。

核磁共振定量技術（qNMR）不受殘留溶劑、水分、無機雜質（灰分）及活性成分雜質的影響，測定對照品的絕對含量，其測定時間短、樣品量少等優點[6]，近年來廣泛應用在對照品和藥品的質量控制研究領域[7-12]，應用qNMR對原薯蕷皂苷對照品含量測定未見報道。本文應用qNMR測定原薯蕷皂苷含量，為在無對照品情況下進行含量測定和相應質量控制建立方法。

圖1 原薯蕷皂苷的化學結構Fig.1 Chemical construction of protodioscin

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCEII 500MHz超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；1～200μL移液槍（Thermo公司）。

氘代吡啶（氘代度＞99.9%美國CIL公司）；TMS（北京化工廠）；原薯蕷皂苷（102498江蘇永健醫藥科技有限公司）；RFS-Y13011812016（成都瑞芬思生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備

內標溶液配制 1μL內標加3mL吡啶配成濃度為0.22mg·mL-1溶液。

樣品溶液配制 稱量原薯蕷皂苷對照品2.7mg，溶解在0.4mL含有內標溶液的吡啶溶劑中。

線性溶液配制 將20mg標準品溶解在1mL的吡啶溶劑中配成濃度為20mg·mL-1的標準溶液，依次往核磁管加入上述100,150,200,250,300μL標準溶液，再依次加入300,250,200,150,100μL的吡啶溶劑。

1.2.2 核磁實驗條件

1H NMR的工作頻率為500.13MHz，譜寬為50000.50Hz，測試溫度為25℃，環境濕度為45%，采集時間3s，掃描次數16次，激發脈沖為12.11us。在對譜圖進行處理之前，先進行相位校正和基線調平。所有譜圖均采用Topspin 4.0.8軟件處理。

1.2.3 qNMR計算公式

采用（1）式計算原薯蕷皂苷對照品含量：

式中 As、Ar：供試品特征峰和內標峰的峰面積；Ms、Mr：供試品和內標物的分子量；ns、nr：供試品特征峰和內標物的質子數；ms、mr：供試品和內標物的質量；Wr：內標物的質量分數。

2 結果與討論

2.1 原薯蕷皂苷氫譜解析

按照NMR實驗條件測定結果采集圖譜，樣品及內標的氫譜見圖2，樣品的氫譜解析見表1。

表1 原薯蕷皂苷核磁共振氫譜特征信號的歸屬Tab.1 1H NMR data for protodioscin in pyridine-d5

因原薯蕷皂苷和TMS在氘代吡啶中溶解度良好，且氘代吡啶的溶劑峰處于較低場，與內標物和樣品特征峰無干擾，因此，選擇氘代吡啶為溶劑。采用NMR對物質進行定量時，供試品與內標物通常會有很多峰。按qNMR定量要求，用于定量的供試品特征峰和內標峰應選擇與其它峰完全分離，沒有雜質峰干擾。按照上述要求，選擇TMS作為內標峰，以原薯蕷皂苷的峰δ5.84為供試品的定量峰。

2.2 線性關系

取1.2.1項下5個供試品的溶液，測定氫譜，分別對原薯蕷皂苷特征峰和TMS內標信號的峰面積進行積分，結果見表2。

表2 原薯蕷皂苷和TMS的質量及峰面積積分值Tab.2 Mass and peak area integral value of protodioscin and TMS

以原薯蕷皂苷特征峰和TMS的積分面積比值y對原薯蕷皂苷和TMS質量比值x做線性方程，得到回歸方程為y=0.2035x-0.572，其相關系數r=0.994。結果表明，線性關系良好。

2.3 精密度試驗

取“線性”項下4號樣品，按照1.2.2項實驗條件連測6次，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計算分別為1.03、1.02、1.03、1.02、1.02、1.03，RSD為0.53%，表明精密度良好。

2.4 重復性試驗

按照1.2.1項下供試品溶液制備，平行制備供試品溶液6份，按照1.2.2項實驗條件進行測定，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計算分別為0.68、0.68、0.68、0.68、0.67、0.68，RSD為0.60%，表明重復性良好。

2.5 穩定性試驗

取“線性”項下4號樣品，按照1.2.2項實驗條件，分別于0、4、6、8、10h測定，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計算分別為1.02、1.01、1.02、1.02、1.03，RSD為0.69%，表明穩定性良好。

2.6 耐用性試驗

取“線性”項下4號樣品，分別在溫度為25和30℃下測定，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計算分別為1.03、1.04，RSD為0.68%，表明耐用性良好。

2.7 樣品測定

按照1.2.1項下供試品溶液制備，測定原薯蕷皂苷對照品的特征峰及其內標TMS的積分面積，根據計算公式（1）求得原薯蕷皂苷的絕對含量，同時采用HPLC峰面積歸一化法測定原薯蕷皂苷對照品的相對含量，結果見表3。

表3 原薯蕷皂苷含量測定結果Tab.3 Determination results of the content of protodioscin

3 結論

本文采用qNMR測定原薯蕷皂苷對照品含量，結果其線性、精密度、耐用性、重復性、穩定性均良好。qNMR法相對于常規方法具有以下優點，核磁信號能給出樣品結構信息，無需特定對照品，內標物廉價易得，方法簡便快捷。因此，qNMR測定原薯蕷皂苷對照品含量的方法可行，具有進一步研究的潛力與價值。