殼寡糖抑制肺癌細胞系惡性增殖相關機制的探討

劉丘崗

肺癌患病率逐年增加，且具有極高的死亡風險，非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)是其主要病理類型之一[1]。當下臨床治療肺癌患者的措施諸多，然而尚未發現可有效根治該疾病的手段，患者5年生存率極低[2]。臨床實踐證實，盡管肺癌患者在早期診斷后得到有效的外科治療，但其亦可出現繼發局部轉移或全身系統性轉移，甚至導致死亡[3-4]。故探尋肺癌發病機制及相關基因對闡明腫瘤細胞轉移及增殖具有重要價值。p53基因突變或失活在多類型癌癥起病及演變過程中占據重要地位，如其可在50%左右的癌癥中出現突變，并參與介導致癌信號[5]。p53是抑癌基因療法中至關重要的一部分，其已成為臨床實踐基因療法的主要試驗基因之一[6]。殼寡糖水溶性良好，細胞親和性較強，同時亦可與器官組織相容，有報道顯示，其抗菌性、抗氧化性、抗癌作用顯著[7]。臨床研究證實，殼寡糖可促進諸多細胞凋亡，但針對其在肺癌中的作用及其機制尚未完全揭示[8]。故本次研究基于p53介導自噬通路，旨在探討殼寡糖抑制肺癌細胞系惡性增殖的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑、儀器

1.1.1 細胞株 肺癌細胞系A549購于沈陽康沐瑞達生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 殼寡糖購于上海雅吉生物科技有限公司；DMSO購于北京伊塔生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶購于武漢華聯科生物技術有限公司；鼠抗Bcl-2、Bax、Survivin抗體購于艾美捷科技有限公司；DAB顯色劑購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 儀器 熒光顯微鏡購于廣州科適特科學儀器有限公司；凝膠成像系統購于普邁精醫科技(北京)有限公司；超凈工作臺購于上海輔澤商貿有限公司；倒置顯微鏡購于上海土森視覺科技有限公司；CO2培養箱購于；高速冷凍離心機購于杭州諾丁科學器材有限公司；酶標儀購于北京安麥格貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將肺癌細胞系A549置于1640培養基(含10%胎牛血清)中培養，然后放入CO2培養箱中孵育。密切關注細胞生長情況，待其處于對數生長期時進行后續研究。

1.2.2 細胞分組 將A549細胞隨機分為陰性對照組、殼寡糖低濃度組、殼寡糖中濃度組、殼寡糖高濃度組，并分別予以0、1、2、5 mg·ml-1殼寡糖處理24 h。

1.2.3 MTT法測定A549細胞增殖能力 將處于對數生長期的細胞制成細胞懸液，以每孔6×103個細胞植于96孔板，每組設置5個復孔，然后將細胞放入CO2培養箱中孵育。分別于24 h、48 h、72 h時向每孔中加入20 μl 5.0 mg·ml-1MTT，4 h后置于離心機中以每分鐘3000轉的速度離心10 min，棄上清液并于每孔中加入150 μl DMSO，震蕩15 s后于波長490 nm處檢測吸光度值，同時分析其增長抑制率。細胞增長抑制率(%)=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.2.4 Hoechst染色法測定A549細胞凋亡形態 將處于對數生長期的細胞制備細胞懸液，并將其濃度調整為1×105個/ml，同時植于6孔板中，常規孵育24 h，待其貼壁后經0.25%胰酶消化、離心機離心后收集細胞。取提前冷處理的Buffer A沖洗3次并轉至新的無菌EP管中，加入1 ml 4%甲醛固定液固定15 min，再次離心并棄上清液，采用Buffer A沖洗3次重懸細胞。將2滴細胞懸液加于載玻片中央制備細胞涂片，并放在室溫下自然風干。加2滴Hoechst 33258工作液于圖片，在室溫下封閉反應15 min，然后采用蒸餾水沖洗，于紫外光波長340 nm處激發，并于顯微鏡下觀察。

1.2.5 流式細胞術測定A549細胞凋亡率 將處于對數生長期的細胞制備細胞懸液，并將其濃度調整為1×105個/ml，同時植于培養瓶中，常規孵育24 h，采用0.25%胰酶進行常規消化，并放在離心機以每分鐘1000轉的速度離心10 min，吸棄上清液后取 PBS液重懸細胞，再次放入離心機以1000轉的速度離心10 min，棄上清液后加入結合緩沖液及5 μl Annexin V-FITC，輕輕晃動使其充分混勻，放在室溫下自然孵育15 min，離心棄上清液；加入10 μl碘化丙啶輕輕晃動并使其充分混勻，于室溫下孵育15 min采用流式細胞儀檢測。

1.2.6 western blot檢測A549細胞凋亡相關蛋白[Bcl-2、Bax、生存素(Survivin)]及p53(p53、p-p53)通路相關蛋白表達水平 取處于對數生長期的細胞提取總蛋白，同時應用BCA蛋白定量試劑盒檢測其蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳、轉膜至PVDF膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色后進行顯影及定影，然后采用凝膠成像系統采集圖像，最后對圖像進行分析處理。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 殼寡糖對A549細胞增殖能力的作用

在24 h、48 h、72 h時，殼寡糖濃度組A549細胞系增殖抑制率較陰性對照組顯著升高，且呈時間濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組A549細胞增殖抑制率比較

2.2 殼寡糖對A549細胞凋亡能力的作用

殼寡糖濃度組A549細胞凋亡率較陰性對照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表2。陰性對照組A549細胞染色較淡，表現為暗藍色；殼寡糖濃度組A549細胞發生凋亡，出現核固縮、變小、核碎裂等現象，且和染色較深，表現為亮藍色，同胞內及胞周存在顆粒狀深染物質。

表2 各組A549細胞凋亡率比較

2.3 殼寡糖對A549細胞凋亡蛋白表達的影響

殼寡糖濃度組A549細胞Bcl-2、Survivin蛋白表達水平均較陰性對照組顯著降低，Bax蛋白表達水平均較陰性對照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖1。

A為陰性對照組；B：殼寡糖低濃度組；C為殼寡糖中濃度組；D為殼寡糖高濃度組； a表示與陰性對照組相比，P<0.05；b表示與殼寡糖低濃度組相比，P<0.05；c表示與殼寡糖中濃度組相比，P<0.05。

2.4 殼寡糖對A549細胞p53信號通路蛋白表達水平的影響

殼寡糖濃度組A549細胞中p53、p-p53、beclin 1蛋白表達水平陰性對照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖2。

3 討論

殼寡糖由甲殼素脫乙酰基并降解所得，易被人體吸收。Xu[9]研究表明，殼寡糖在肝癌、結腸癌、肺癌、等腫瘤中發揮明顯的抗腫瘤作用，然而該過程涉及方面諸多，十分復雜。近年來多項研究顯示，殼寡糖抗腫瘤作用機制主要是通過促進癌細胞凋亡及壞死實現的[10]。Pae等[11]研究證實，殼寡糖既可阻斷人原髓細胞白血病細胞HL-60生長，亦可誘導該細胞凋亡，且該過程中存在細胞周期異常。但目前針對p53介導的自噬通路在肺癌細胞系中的作用及其機制尚未有研究進行探究，因此本研究將進一步進行分析。

A為陰性對照組；B為殼寡糖低濃度組；C為殼寡糖中濃度組；D為殼寡糖高濃度組； a表示與陰性對照組相比，P<0.05；b表示與殼寡糖低濃度組相比，P<0.05；c表示與殼寡糖中濃度組相比，P<0.05。

本次研究中我們分別于不同時間段采用MTT法對各組A549細胞增值抑制率進行分析，結果發現，不同時間段內殼寡糖濃度組A549細胞系增殖抑制率較陰性對照組顯著升高。此外我們亦采用Hoechst染色及流式細胞術對各組細胞凋亡形態及凋亡率進行檢測分析，發現殼寡糖濃度組A549細胞凋亡較陰性對照組顯著升高，殼寡糖濃度組A549細胞發生明顯凋亡，表現為亮藍色，且殼寡糖濃度為5.0 mg·ml-1時細胞增殖抑制作用及促凋亡作用最顯著。以上結果提示殼寡糖抗腫瘤效果顯著。Bcl-2可有效抑制細胞凋亡能力，主要是通過阻斷Bax及Bak活性進行的。Survivin可發揮腫瘤特異性，且在癌細胞即胚胎組織中存在表達。董永強等[12]研究證實，Survivin可作為半胱天冬氨酶-3、半胱天冬氨酶-7直接阻斷劑進而抑制諸多因素刺激產生的細胞凋亡環節，亦可與周期相關蛋白激酶相互作用發揮凋亡信號轉導途徑抑制作用。Western blot檢測結果顯示，殼寡糖濃度組A549細胞Bcl-2、Survivin蛋白表達水平均較陰性對照組顯著降低，Bax蛋白表達水平均較陰性對照組顯著升高，且呈濃度依賴性。提示殼寡糖抗促凋亡作用可能是通過上調促凋亡蛋白Bax表達及下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達進行的，而肺癌細胞增殖抑制作用可能是通過阻斷半胱天冬氨酶家族抑制劑Survivin表達實現的，可為殼寡糖抗腫瘤作用提供實驗理論基礎。針對p53抗腫瘤生物學作用主要由兩方面入手，一是其可阻斷細胞分裂過程，將細胞阻滯于G1期繼而發揮抗腫瘤作用；二是p53可通過介導細胞凋亡及自噬發揮抗腫瘤作用，其中后者是p53阻斷腫瘤生物學功能的主要通路，阻斷腫瘤進展效果顯著。beclin 1是1種具有抗腫瘤作用的自噬相關調節基因，其抗腫瘤作用機制主要是通過促進細胞自噬及凋亡達到阻斷腫瘤進展的目的[13-14]。王文玉等[15]研究證實，beclin 1可明顯阻斷體外A549細胞系及裸鼠體內A549細胞系增殖能力，而應用藥物可促進自噬發生，可在一定程度上增強癌細胞對放化療敏感性。殼寡糖濃度組A549細胞中p53、p-p53、beclin 1蛋白表達水平陰性對照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。提示殼寡糖可通過調控p53介導的自噬通路進而上調p53、p-p53、beclin 1蛋白表達水平實現肺癌細胞增殖抑制及誘導凋亡。

綜上所述，殼寡糖可抑制肺癌細胞系惡性增殖并促進細胞凋亡，其作用機制可能是通過調節凋亡相關Bcl-2、Survivin、Bax表達及p53介導的自噬通路實現的。