CDKN2A基因突變對肺癌的影響及與預(yù)后的關(guān)系

程 霞 牛民強(qiáng) 王 寧 劉會敏 黑君芳

隨著空氣質(zhì)量的惡化，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為我國發(fā)病率最高的癌癥[1]。肺癌患者常表現(xiàn)為咳嗽、胸痛、氣喘等癥狀，易與肺結(jié)核等肺部良性疾病混淆，早期診斷較為困難，因此，尋求一種有效的早期診斷方式對肺癌的治療至關(guān)重要。CDKN2A基因也稱多重腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，能夠調(diào)控細(xì)胞生長、增殖過程。有報道指出，CDKN2A基因有可能成為肺癌分子靶向治療的新方向，這表示CDKN2A基因的表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)[2]，但目前對于其與肺癌發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系尚有爭議。因此，本研究通過分析肺癌患者CDKN2A基因表達(dá)情況，旨在研究CDKN2A基因在肺癌組織中表達(dá)及其診斷和預(yù)后價值，為肺癌的早期診斷及治療提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2015年1月至2016年6月在我院治療的肺癌患者63例，均符合《肺癌影像診斷與臨床新進(jìn)展》關(guān)于肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肺癌者，并且在術(shù)前未進(jìn)行放化療治療者。男性38例，女性25例；年齡42～75歲，平均(56.39±8.05)歲；組織學(xué)分型：腺癌20例、鱗癌16例、腺鱗癌15例、小細(xì)胞肺癌12例。排除：嚴(yán)重心肝腎功能異常者；肺部良性疾病患者；其他原發(fā)性惡性腫瘤患者；預(yù)期存活期≤3個月者；放棄治療者。

1.2 方法

收集肺癌患者手術(shù)前癌變組織及癌旁組織(距腫瘤5 cm處，經(jīng)快速病理診斷為正常組織)樣本，提取總RNA，應(yīng)用北京厚生博泰科技有限公司RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，基因序列見表1。總反應(yīng)體系為25 μl(RNA模版4 μl+上下游引物各2 μl+2*Tap PCRMasterMix 12 μl+雙蒸水)，在95 ℃下預(yù)處理5 min，并在熱變性溫度95 ℃下處理30 s，在延伸溫度72 ℃下處理30 s，然后延伸10 min(60 ℃、61 ℃、59 ℃，30個循環(huán))，最后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)第二代測序原理分析基因檢測結(jié)果[4]。

表1 基因序列

1.3 隨訪情況

采用電話隨訪或門診復(fù)診的方式對患者生存情況進(jìn)行隨訪，隨訪時間為術(shù)后3年或截止至死亡時間，第1年每3個月隨訪1次，后兩年每6個月隨訪1次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

研究所得數(shù)據(jù)均用SPSS 17軟件處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗比較組間差異；計量資料經(jīng)用t檢驗比較組間差異；采用ROC曲線分析CDKN2A基因?qū)Ψ伟┑脑\斷價值；采用COX回歸分析影響肺癌預(yù)后的獨立危險因素；采用Log-rank檢驗對生存曲線進(jìn)行比較。P<0.05即差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者癌組織和癌旁組織CDKN2A基因突變率比較

癌組織中CDKN2A基因突變率為38.09%(24/63)，高于癌旁組織的7.94%(5/63)(χ2=16.170，P=0.000)。

2.2 肺癌組織CDKN2A基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

CDKN2A基因突變型患者和野生型患者在年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、分化程度等方面對比無明顯差異(P>0.05)；CDKN2A基因突變型患者復(fù)發(fā)率為45.83%，高于CDKN2A基因野生型患者的17.95%(P<0.05)，見表2。

表2 肺癌組織CDKN2A基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 CDKN2A基因突變診斷肺癌的ROC曲線分析

經(jīng)ROC曲線分析得，CDKN2A基因突變診斷肺癌的AUC為0.817(95%CI：0.739～0.881；P<0.05)，靈敏度為65.08%，特異度為98.41%，見圖1。

圖1 CDKN2A基因突變診斷肺癌的ROC曲線

2.4 肺癌組織CDKN2A基因表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

CDKN2A基因突變型患者3年生存率為45.83%(11/24)，CDKN2A基因野生型患者3年生存率為74.36%(29/39)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.488，P=0.019)，見圖2。

圖2 肺癌組織CDKN2A基因表達(dá)與預(yù)后的生存曲線

2.5 影響肺癌患者術(shù)后生存期的獨立危險因素COX回歸分析

經(jīng)Logisitic回歸分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺癌分期高、腫瘤大小≥3 cm、CDKN2A基因突變?yōu)橛绊懛伟┗颊咝g(shù)后生存期的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響肺癌患者術(shù)后生存期的獨立危險因素COX回歸分析

3 討論

有報道指出，腫瘤的發(fā)生是因為正常細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了突變或失活[5]。有研究指出，在肺癌、乳腺癌、骨腫瘤及皮膚癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)CDKN2A基因純合子缺失，其異常表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)[6-7]。CDKN2A基因是一種新抗癌基因，能夠參與細(xì)胞周期的調(diào)控，抑制細(xì)胞增殖和分裂，而腫瘤細(xì)胞增殖速度較正常細(xì)胞快，這可能是因為腫瘤細(xì)胞CDKN2A基因突變或失活，從而使其增殖分化速度增加。本研究中，癌組織中CDKN2A基因突變率高于癌旁組織，這表明CDKN2A基因突變可能與腫瘤發(fā)生過程有關(guān)，但本研究檢測肺癌患者癌組織CDKN2A基因突變率38.09%，略高于林振中等[8]研究，這可能與本研究樣本量少及CDKN2A基因陽性表達(dá)的檢測方法不同有關(guān)。

目前國內(nèi)外有報道指出，CDKN2A基因表達(dá)水平與肺癌的發(fā)生過程有關(guān)[9-11]。CDKN2A基因是一種抑制細(xì)胞過度生長、繁殖從而遏制腫瘤形成的負(fù)調(diào)節(jié)基因，它與調(diào)控生長的原癌基因協(xié)調(diào)表達(dá)以維持細(xì)胞正常生長、增殖和分化，CDKN2A基因突變不僅會喪失其原有的抑癌作用，還會促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。閆洪生等[12]研究也指出，CDKN2A基因的突變或失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。CDKN2A基因位于人第9號染色體短臂上，其發(fā)生突變時外顯子編碼的蛋白質(zhì)可直接調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化，導(dǎo)致癌細(xì)胞的產(chǎn)生及惡化。王玉等[13]研究證實了，CDKN2A基因的失活與突變參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，這提示可通過檢測CDKN2A基因的突變情況來診斷肺癌。本研究經(jīng)ROC曲線分析，CDKN2A基因突變診斷肺癌的AUC為0.706，說明CDKN2A基因突變對肺癌具有診斷價值。

正常細(xì)胞分裂周期的完成關(guān)鍵，主要是G1期至S期的順利轉(zhuǎn)化。有研究指出，CDKN2A基因通過對一系列關(guān)鍵底物磷酸化作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，并且可抑制Cdk4活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，一旦CDKN2A基因缺失、突變導(dǎo)致正常功能缺失，則不能抑制CDK4，最終導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入惡性增殖，加速腫瘤發(fā)生[14-15]。CDKN2A基因可通過編碼蛋白調(diào)控細(xì)胞生成的特異基因轉(zhuǎn)錄，其基因缺失時會使其不再抑制原癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，從而增大腫瘤體積，促使癌細(xì)胞惡化或轉(zhuǎn)移，不利于患者預(yù)后。本研究經(jīng)Logisitic回歸分析得，CDKN2A基因突變型患者復(fù)發(fā)率為41.67%，高于野生型患者的20.51%(P<0.05)；CDKN2A基因突變是影響肺癌患者術(shù)后生存期的獨立危險因素；CDKN2A基因突變型患者3年生存率低于野生型患者，說明CDKN2A基因突變型患者預(yù)后較差，與林振中等[16]研究結(jié)果相同。這表示可通過檢測肺癌患者CDKN2A基因表達(dá)來預(yù)測預(yù)后情況。另外本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響肺癌預(yù)后的獨立危險因素，說明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者預(yù)后較差，與殷航等[17]研究結(jié)果相同，這可能是因為淋巴結(jié)遍布全身，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移意味著癌細(xì)胞會順著淋巴循環(huán)到達(dá)各組織器官，加重患者病情，降低治療效果，不利于預(yù)后。

綜上所述，肺癌患者癌組織CDKN2A基因突變率高于癌旁組織，CDKN2A基因突變對肺癌具有預(yù)測價值，且為影響肺癌患者術(shù)后生存期的獨立危險因素，因此可通過檢測CDKN2A基因突變情況來初步判斷患者是否患有肺癌及預(yù)測患者預(yù)后。