柱色譜分離-分子篩絡合洗脫過程中正構烷烴單體碳同位素分餾研究

董浩偉， 趙佳玉， 曾凡剛， 謝曼曼， 尚文郁， 王淑賢*， 孫青*

(1.國家地質實驗測試中心，北京100037；2.中國科學院地質與地球物理研究所新生代地質與環境重點實驗室， 北京100029；3.中國科學院地球科學研究院，北京100029；4.中國科學院大學，北京100049；5.中國人民大學環境學院，北京100872)

來源于生物體的正構烷烴能夠較穩定地保存于地質體中[1-2]。不同鏈長的正構烷烴能夠大致“標記”其物質來源。短鏈正構烷烴(nC15～nC21)主要來源于水體中的藻類和微生物[3]；中鏈正構烷烴(nC23～nC25)主要來源于挺水植物、浮水植物和苔蘚[4]；長鏈正構烷烴(nC27～nC35)則主要來源于陸生高等植物[5]。不同鏈長的正構烷烴單體碳同位素被廣泛應用于示蹤沉積物物源[6-11]，重建古植被[12]、古氣候[13-17]、古環境[18-22]和古地形[23]等。例如，Rommerskirche等[12]對比了全新世非洲大陸邊緣沉積物的孢粉和正構烷烴單體碳同位素數據，指出正構烷烴單體碳同位素可以有效地重建植被演變歷史。Yamada等[18]分析了日本海洋沉積物的長鏈正構烷烴單體碳同位素(n-δ13C29、n-δ13C31)，重建了日本南部距今8.5萬年以來的古環境演變歷史。饒志國等[24-25]對比研究了中國東部表土總有機質碳同位素和長鏈正構烷烴碳同位素，指出表土總有機質碳同位素和陸生高等植物來源的長鏈正構烷烴碳同位素同等有效地記錄了來源植被中C3/C4植物的相對生物量貢獻。

利用氣相色譜-氣體同位素質譜儀(GC-C-IRMS)分析正構烷烴單體碳同位素之前，需要對飽和烴樣品中正構烷烴和異構烷烴進行預分離、富集處理，目的是減少未分峰和共流出的干擾，并滿足同位素質譜儀的檢出限，提高分析的精密度和準確度[26-32]。目前，分離富集樣品中正構烷烴的常用方法有硫脲絡合法、尿素絡合法、高效液相色譜法、柱色譜法、氣相色譜法和5?分子篩法等[33-36]。其中5?分子篩法包括氫氟酸酸解法和混合溶劑洗脫法。氫氟酸酸解法使用氫氟酸破壞分子篩結構釋放正構烷烴，但氫氟酸毒性較大、不安全。混合溶劑洗脫法采用正戊烷、環己烷混合溶劑進行洗脫，需要經過柱色譜、5?分子篩絡合、環己烷-正戊烷混合溶劑多次洗脫過程，前處理流程復雜，影響因素多，回收率不穩定。前處理過程中正構烷烴單體碳同位素是否發生分餾，是正構烷烴單體碳同位素高精度分析的關鍵。

已有研究表明正構烷烴回收率約50%或以上時，5?分子篩法不會造成正構烷烴單體同位素分餾。例如，Tolosa等[34]研究了樣品經5?分子篩絡合、氫氟酸溶解后得到的正構烷烴，發現正構烷烴回收率平均值為53%時碳同位素沒有發生明顯分餾。張逐月等[28]應用5?分子篩絡合、環己烷-正戊烷混合溶劑洗脫分離富集正構烷烴，正構烷烴回收率平均值為59%，正構烷烴單體碳同位素分析精度優于0.38‰，沒有發生明顯同位素分餾。Grice等[33]發現石油樣品經5?分子篩絡合混合溶劑洗脫，正構烷烴回收率基本在90%以上，未觀察到前處理造成正構烷烴的碳同位素分餾。上述研究表明，當正構烷烴回收率較高時，前處理過程不會對單體同位素值造成影響。然而，當回收率較低時，前處理過程是否會引起碳同位素分餾，以及前處理中各步驟是否會導致正構烷烴單體同位素變化仍有待開展深入研究。本文以正構烷烴混合溶液為對象，分析了經柱色譜、5?分子篩絡合、混合溶劑洗脫前后的正構烷烴單體碳同位素比值，討論了柱色譜分離前后、5?分子篩不完全絡合前后、兩次洗脫處理前后、正構烷烴不同洗脫回收率時的正構烷烴單體碳同位素變化特點，著重探討正構烷烴低回收率時，前處理過程是否會引起正構烷烴單體碳同位素分餾。

1 實驗部分

1.1 儀器及工作條件

GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)，柱箱初始溫度為60℃，以10℃/min程序升溫至250℃，再以6℃/min程序升溫至320℃，恒溫7min。

TraceGC ULTRA-GC ISOLINK接口-MAT253質譜儀(美國ThermoFisher公司)。柱箱初始溫度為70℃，以4℃/min程序升溫至320℃，保持10min。氧化爐溫度1000℃。

EG20A plus電熱板(北京萊伯泰科儀器有限公司)；XMTA-C9000馬弗爐(天津市泰斯特儀器有限公司)。

載氣：高純氮氣和高純氦氣(99.999%，北京市北溫氣體制造廠)。

1.2 材料和主要試劑

硅膠：500mg/3mL SPE硅膠柱(美國Waters公司)。

接收瓶：60mL透明收集瓶(美國ThermoFisher公司)。

正戊烷、正己烷、環己烷、二氯甲烷：色譜純(美國ThermoFisher公司)。

工作標準：nC7～nC40正構烷烴混合工作標準(美國Sigma公司)。

正構烷烴：nC15、nC17、nC21、nC22、nC24、nC26(色譜純，美國Sigma公司)；nC18、nC28、nC32、nC36(分析純，上海安譜公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1模擬樣品配制

模擬樣品是由nC15、nC17、nC18、nC21、nC22、nC24、nC26、nC28、nC32、nC36正構烷烴配制而成，單體濃度約為500μg/mL。

1.3.2柱色譜分離

選用500mg/3mL SPE硅膠柱，經2mL正戊烷淋洗獲得飽和烴組分。

1.3.35?分子篩絡合與分析

5?分子篩在使用前需在450℃連續活化24h，活化后放置于干燥器中保存。

樣品置于60mL接收瓶中，加入適量活化好的分子篩和環己烷。將接收瓶密封，80℃加熱24h。加熱結束后待容器冷卻至室溫，收集上清液并濃縮。用環己烷沖洗分子篩4～5遍，并將沖洗溶劑與前次收集的上清液合并濃縮。利用氣相色譜分析其中正構烷烴含量，GC-C-IRMS分析正構烷烴單體碳同位素值。

1.3.45?分子篩洗脫與分析

在裝有5?分子篩的ASE接收瓶中，加入體積比為91∶9的正戊烷和環己烷混合溶劑。密封加熱(85℃，8h)，第一次洗脫后將此次洗脫液濃縮、定容，用氣相色譜和GC-IRMS分別測定正構烷烴含量及其單體碳同位素值；第二次洗脫后將此次洗脫液濃縮、定容，同樣用氣相色譜和GC-IRMS分別測定正構烷烴含量和單體碳同位素值。

本文涉及的未絡合率、柱色譜回收率、5?分子篩回收率定義如下：

碳同位素比值(δ13C)，按如下公式計算：

式中：碳同位素比值δ13C以δ13C-VPDB表示。

2 結果與討論

2.1 儀器穩定性檢驗

單體碳同位素分析中儀器狀態的穩定是數據質量的保證[29]。在相同實驗條件下每隔6個樣品穿插分析一次正構烷烴工作標準單體碳同位素，計算其標準偏差(SD)，進行儀器穩定性檢驗。正構烷烴工作標準單體碳同位素分析精度優于0.2‰(表1)，表明儀器狀態穩定[26-29]，正構烷烴δ13C測定結果可靠。

表1 工作標準的δ13C值

2.2 柱色譜分離前后單體碳同位素比值對比

柱色譜分離是由液固萃取柱和液相色譜技術相結合發展而來的分離、凈化方法，它是生物標志化合物[37]和有機污染物[38-39]單體同位素分析常用的處理方法。Benbow等[40]認為柱色譜處理會引起水溶性有機化合物碳同位素分餾，但柱色譜處理是否會導致脂溶性正構烷烴碳同位素分餾有待進一步研究。

本文利用柱色譜處理配制的模擬樣品，柱色譜處理前后的正構烷烴回收率為86%～93%。柱色譜處理后，多數正構烷烴單體碳同位素比值與模擬樣品相差-0.2‰～0.2‰(圖1)，同位素分析精度與柱色譜分離水溶性有機化合物碳同位素分析精度[40]相似，表明柱色譜處理前后正構烷烴單體碳同位素沒有發生分餾。僅n-δ13C32差值較大(-0.7‰，圖1)，可能是因為nC32工作標準中含有一定雜質，對碳同位素比值的測定造成了影響。

圖1 過柱后單體碳同位素與模擬樣品碳同位素的差值Fig.1 Difference between compound specific carbon isotope and simulate sample carbon isotope after passing through the SPE column

a—正構烷烴未絡合率； b—正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品的差值。圖2 不同未絡合率正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品的差值Fig.2 Difference between carbon isotopes of n-alkanes with different uncomplexation ratios and simulate sample. (a) The uncomplexation ratio of n-alkanes; (b) The difference value between carbon isotopes of n-alkanes and simulate sample

2.3 5?分子篩不完全絡合前后單體碳同位素比值對比

實驗設計了樣品未被5?分子篩完全絡合的情況，試圖探討樣品中正構烷烴不完全絡合時單體碳同位素是否會產生明顯分餾。

在絡合時間、絡合溫度、正構烷烴含量等條件不變的情況下，通過減少5?分子篩加入量，使得正構烷烴發生不同程度地不完全絡合，未絡合率為10%～50%(圖2a)。其中低碳鏈正構烷烴的未絡合率較低，高碳鏈正構烷烴的未絡合率較高，其原因可能是低碳鏈正構烷烴容易被分子篩絡合，或濃縮過程中更易發生揮發損失[27-28]。將未絡合的正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品進行對比，發現未絡合的單體碳同位素整體偏重(平均值約0.7‰，圖2b)，短鏈(nC15～nC21)正構烷烴比中長鏈(nC23～nC35)偏重更顯著。雖然分析過程中，未絡合正構烷烴的比例一般較小，但考慮到未絡合部分的單體碳同位素發生了微弱的同位素分餾，建議分析過程中盡量避免正構烷烴的不完全絡合。

2.4 兩次洗脫處理前后單體碳同位素比值對比

由于同位素質譜儀的檢出限較高，而一些環境樣品中的正構烷烴含量低，為了滿足分析要求，需要采用多次洗脫以提高樣品中正構烷烴的回收率[27-28]。例如，陳莎莎等[27]對樣品進行了三次混合溶劑洗脫，正構烷烴平均回收率提高了19%。張逐月等[28]對土壤樣品進行了兩次混合溶劑洗脫，也證明了兩次洗脫會對正構烷烴回收率有所提高。但多次洗脫需要多次長時間的加熱，可能會導致正構烷烴單體碳同位素發生分餾[27]。

本實驗中，樣品經過5?分子篩完全絡合后，利用混合溶劑洗脫兩次，分析正構烷烴回收率及單體碳同位素比值。第一次洗脫后正構烷烴回收率為37%～90%，短鏈正構烷烴回收率大于50%，中鏈正構烷烴回收率較高(大于70%)，而長鏈正構烷烴回收率較低(約40%)。第二次洗脫后正構烷烴回收率增加了5%～17%，其中長鏈正構烷烴的回收率顯著提高(圖3a)。

第一次洗脫后獲得的正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品相差在-0.2‰～0.5‰，第二次洗脫后此差值在-0.3‰～0.2‰。兩次洗脫獲得的正構烷烴碳同位素比值均在分析誤差之內，未發生整體的偏輕或偏重(圖3b)。中短鏈正構烷烴單體碳同位素偏差較小，但長鏈n-δ13C32和n-δ13C36偏差較大，可能是因為模擬樣品中含有一定雜質，對nC32、nC36碳同位素分析造成了影響。實驗結果表明，兩次洗脫不會導致正構烷烴單體碳同位素分餾。

a—正構烷烴回收率； b—正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品的差值。圖3 不同洗脫回收率正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品的差值Fig.3 Difference between monomer carbon isotope of n-alkanes and simulate sample with different elution recoveries. (a) The recovery rate of n-alkanes; (b) The difference value between carbon isotopes of n-alkanes and simulate sample

2.5 正構烷烴不同洗脫回收率時的碳同位素比值對比

在絡合時間、絡合溫度等條件不變的情況下，模擬樣品經過5?分子篩處理得到不同回收率的正構烷烴。影響正構烷烴回收率的原因有：①改變分子篩加入量。例如回收率17%是減少分子篩用量、不完全絡合造成的；②與氮吹濃縮有關[27-28]；③沖洗分子篩時，振蕩不充分導致正構烷烴不完全洗脫[28]；④空氣濕度的變化[41]等。由圖4a可知，中短鏈正構烷烴回收率較高，nC32～nC36回收率較低。如nC15～nC25正構烷烴回收率為15%～80%，nC32～nC36正構烷烴回收率為10%～40%。

正構烷烴回收率及絡合率不同的情況下，其碳同位素與模擬樣品碳同位素的差值基本在0.3‰以內(圖4b)，表明回收率及絡合率均不會對同位素比值造成影響。這與前人的研究結果一致[27-29，33-34]。但是前人的研究多集中在高回收率的樣品，而本實驗結果表明正構烷烴單體回收率低至20%，或高至90%，前處理未對正構烷烴單體碳同位素造成明顯的分餾。

a—正構烷烴回收率； b—正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品的差值。圖4 不同回收率正構烷烴單體碳同位素與模擬樣品碳同位素差值Fig.4 Carbon isotope difference between n-alkanes monomer and simulate sample with different recoveries. (a) The recovery rate of n-alkanes; (b) The difference value between carbon isotopes of n-alkanes and simulate sample

3 結論

本研究對比了樣品處理前后正構烷烴的碳同位素比值，結果表明固相萃取-5?分子篩絡合-混合溶劑洗脫前處理過程對正構烷烴單體碳同位素分餾不會造成明顯影響：①固相萃取、混合溶劑兩次洗脫前后正構烷烴單體碳同位素組成不存在顯著差異。②該方法適用于正構烷烴回收率大于20%的樣品中正構烷烴單體碳同位素比值分析。

此外，5?分子篩不完全絡合時，未絡合的單體碳同位素整體偏重，可能會發生微弱的碳同位素分餾，但并未影響洗脫后的正構烷烴單體碳同位素比值，對該現象還有待進一步研究。