肺炎支原體肺炎患兒外周血單個核細胞TIPE2的表達及與Th17/Treg平衡的相關性

張騫，侯瑞霞，張超，張燕霞

（濟南市第二婦幼保健院1.兒科，2.藥劑科，山東濟南271199）

近年來，肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）發病率呈上升趨勢[1-2]。MPP 是常見小兒肺炎，臨床癥狀主要為發熱、咳嗽、咽痛、頭痛等。大量研究發現，MPP 發病機制與肺炎支原體入侵呼吸道上皮細胞、患兒免疫系統功能紊亂有關[1-2]。TIPE2 是一種新型免疫調節蛋白，可參與多種炎癥性疾病的發展。以往研究證實TIPE2 對免疫細胞具有促分泌作用，在小兒哮喘中發揮重要作用[3-4]。輔助性T 細胞17（helper T cell,Th17）、調節性T 細胞（regulatory T cells,Treg）是兩種重要的免疫細胞類型，可分泌相應細胞因子。有研究提示Th17/Treg 比例失調可能與支原體肺炎患兒病情發生、發展有關[5-7]。因此，本研究通過檢測MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2 水平，分析其與Th17/Treg 平衡的關系，初步探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2020年9月濟南市第二婦幼保健院收治的MPP 急性發作期患兒和恢復期患兒各104 例作為研究對象。其中，急性發作組男性50 例，女性54 例；年齡1～11 歲，平均（5.19±2.47）歲。恢復組男性61 例，女性43 例；年齡1～10 歲，平均（5.37±2.01）歲。隨機納入同期本院健康體檢兒童90 例為對照組。其中，男性48 例，女性42 例；年齡1～10 歲，平均（5.26±1.92）歲。對照組兒童均無呼吸系統疾病及其他系統疾病，排除近2 周合并感染史、用藥史兒童。3 組研究對象年齡、性別構成比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組發布的《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）》[8]相關診斷標準；②患兒年齡≤12 歲；③臨床資料完整，患兒家屬均知情并自愿簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準①其他呼吸系統疾病；②合并心、肝、腎、肺等發育不全或功能不全；③合并血液系統疾病患者；④營養不良；⑤其他原因引起的喘息、咳嗽、發熱等或近期發生過呼吸道感染疾病。

1.3 方法

1.3.1 血標本采集收集入院次日MPP 患兒及健康體檢兒童清晨空腹靜脈血4 ml，平均分裝于2 個試管中，其中一只試管為抗凝管，加入人淋巴細胞分離液后分離得到單個核細胞，置于-80℃冷凍保存待測。另一只試管為非抗凝試管，2 000 r/min離心15 min，取上清液置于-80℃保存待測。

1.3.2 實驗室檢測采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測外周血單個核細胞TIPE2，人TIPE 試劑盒購自上海谷研實業有限公司。將分離后的單個核細胞用洗滌液洗滌2 次后重懸于10% FCS RPMI 1640 培養液，熒光標記染色，充分震蕩后再次洗滌2 次，加固定液，染色，制片，熒光顯微鏡下觀察。采用流式細胞術檢測Th17、Treg，ELISA 檢測白細胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）、白細胞介素-35（Interleukin-35,IL-35）、C 反應蛋白（C-reactive protein,CRP）、降鈣素原（Procalcitonin,PCT）水平。人IL-17、人IL-35 試劑盒購自北京百奧萊博生物有限公司，人CRP、人PCT 試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司。均嚴格按照試劑盒說明書步驟進行檢測。

1.3.3 肺功能檢測利用FGC-A+型全自動肺功能檢測儀檢測MPP 患兒肺功能，包括第一秒用力呼氣量（forced expiratory volume in first second,FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、呼氣流量峰值（peak expiratory flow,PEF）。

1.4 觀察指標

比較急性發作組、恢復組MPP 患兒和對照組健康兒童外周血單個核細胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg 及血清IL-17、IL-35、CRP、PCT 水平；比較急性發作組、恢復組MPP 患兒肺功能指標；分析MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2 與Th17、Treg、Th17/Treg、血清IL-17、IL-35、CRP、PCT的相關性；分析影響MPP 發生的危險因素。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；相關性分析用Pearson 法；影響因素的分析采用多因素Logistic回歸模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組外周血單個核細胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指標比較

急性發作組、恢復組與對照組外周血單個核細胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg、TL-17、IL-35、CRP、PCT 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，恢復組、急性發作組MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2、Treg、IL-35 降低（P＜0.05），Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 升高（P＜0.05）；與恢復組比較，急性發作組MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2、Treg、IL-35 降低（P＜0.05），Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 升高（P＜0.05）。見表1。

表1 3組外周血單個核細胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指標比較 （±s）

表1 3組外周血單個核細胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指標比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與恢復組比較，P ＜0.05。

組別急性發作組恢復組對照組F 值P 值n 104 104 90 TIPE2/（pg/ml）28.76±4.17①②42.08±6.34①53.24±8.13 364.251 0.000 Th17/%2.89±0.57①②2.13±0.40①1.29±0.21 338.250 0.002 Treg/%3.16±0.49①②4.22±0.64①5.45±0.83 291.034 0.000 Th17/Treg 0.92±0.18①②0.51±0.13①0.24±0.09 582.865 0.000組別急性發作組恢復組對照組F 值P 值PCT/（μg/L）0.20±0.06①②0.13±0.03①0.05±0.02 320.823 0.000 IL-17/（pg/ml）163.14±37.24①②147.33±25.06①138.14±23.29 18.077 0.000 IL-35/（pg/ml）156.81±39.74①②220.67±57.82①314.11±76.15 172.920 0.000 CRP/（mg/L）23.61±6.42①②9.25±2.87①4.17±1.63 558.022 0.000

2.2 急性發作組和恢復組MPP 患兒肺功能指標比較

急性發作組與恢復組患兒FEV1、FVC、PEF比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），急性發作組FEV1、FVC、PEF 低于恢復組。見表2。

表2 急性發作組和恢復組MPP患兒肺功能指標比較（n=104，%，±s）

表2 急性發作組和恢復組MPP患兒肺功能指標比較（n=104，%，±s）

組別急性發作組恢復組t 值P 值FEV1 62.63±10.48 86.52±16.37 12.534 0.000 FVC 79.22±9.64 94.62±16.37 8.267 0.000 PEF 64.92±9.13 87.81±10.16 17.089 0.000

2.3 MPP患兒外周血單個核細胞TIPE2與各指標的相關性分析

MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2 與Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 呈負相關（P＜0.05），與Treg、IL-35 及FEV1、FVC、PEF 呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表3 MPP患兒血清外周血單個核細胞TIPE2與各指標的相關性分析

2.4 影響MPP的危險因素

以是否發生MPP 為因變量（1=是，0=否），將外周血單個核細胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg 及血清IL-17、IL-35、CRP、PCT 等連續變量納入自變量。一般多因素Logistic 回歸分析結果顯示，和（95% CI：1.047，2.439）]是影響MPP 發生的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響MPP發生危險因素的多因素Logistic回歸分析參數

3 討論

MPP 好發于幼兒群體，與幼兒尚處于生長發育階段，呼吸系統發育不成熟、免疫力低下有關[9]。引起幼兒發生肺炎的主要原因是病原體感染，肺炎支原體是較常見肺炎病原體微生物，長期炎癥浸潤可導致患兒血管內皮損傷、炎性變態反應及凝血系統異常，若未及時就醫或治療效果差，極有可能發展為重癥肺炎，嚴重影響患兒生命健康。探究MPP 發病機制有利于針對性治療MPP 患兒。

TIPE2 屬于TNFAIP8 家族一員，是一種新的先天性和適應性免疫應答的負調控因子，通過與Caspase-8 結合抑制激活蛋白-1 和核因子κB 的活性，促進脂肪酸合成酶Fas 誘導的免疫細胞凋亡[10-11]。本研究結果顯示，MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2 水平明顯低于對照組兒童，且急性發作期MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2 水平明顯低于恢復期患兒，表明TIPE2 水平可能反映MPP 的發生、發展，其具體分子機制尚不清楚。SHI 等[12]報道稱，TIPE2 不僅能維持免疫穩態，而且能調節炎癥反應，TIPE2 受T 細胞受體和Toll 樣受體的激活作用，調控其下游靶信號通路，通過調節多種免疫細胞活性及功能參與哮喘的發病機制。ZHANG 等[13]研究發現，支原體肺炎感染患者外周血單個核細胞TIPE2 mRNA表達明顯降低，且與患者感染嚴重程度有關；進一步體外研究發現，TIPE2 通過抑制MAPK信號通路，負調控肺炎支原體感染誘導的炎癥細胞因子水平，進而參與MPP 的發生、發展，與本研究結果一致。本研究結果顯示，MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2 與IL-17 等炎癥因子呈負相關，提示TIPE2 可能通過調控炎癥信號通路參與MPP 的發生機制，其具體作用方式有待更深入研究。

Th17 細胞是新近發現的一類CD4+T 細胞亞群，由于該細胞亞群可特異性分泌IL-17 而被命名為Th17 細胞。有研究證實，Th17 細胞具有較強的促炎作用，由IL-6 和轉化生長因子-β 共同誘導Th 細胞分化而來[14-15]。多項研究顯示，IL-17 可參與多種自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、關節炎等[16-17]。Treg 是一類具有免疫調節功能的T 細胞亞群。ROMANO 等[18]研究發現，Treg 通過分泌細胞介質抑制T 細胞及抗原傳遞功能，并降低炎癥細胞因子及抗體水平來發揮免疫效應。國內有學者報道，MPP 患兒外周血Th17 細胞增多，Treg 細胞減少，Th17/Treg 比例失衡，且兩者各自分泌的細胞因子表達異常，可能在MPP 發生、發展中發揮重要作用[19]，與本研究結果一致。本研究結果顯示，與對照組比較，MPP 患兒外周血Th17 升高，Treg 降低，Th17/Treg 比值升高，表明MPP 患兒病情發生、發展與免疫細胞代謝紊亂、穩態失衡有關。Treg 細胞是維持自我耐受，防止過度炎癥和自身免疫性疾病所必需的[19]。LI 等[20]研究發現，FOXP3 是Treg 細胞的特異性標志物，對Treg 的生長分化及功能完善起至關重要的作用，FOXP3基因缺失小鼠常伴隨致命的自身免疫疾病、腸道病變、皮屑病等。由此可知，Th17 細胞與Treg 細胞相互作用、相互制約，共同維持機體免疫穩態，若Th17/Treg 平衡被打破，則可能發生炎癥因子浸潤，機體產生嚴重炎癥反應，這可能是MPP 發生的分子機制之一。

本研究通過檢測MPP 患兒肺功能指標發現，急性發作組MPP 患兒FEV1、FVC、PEF 均明顯低于恢復組患兒，表明MPP 患兒肺功能異常，出現阻塞性通氣障礙。CRP、PCT 是診斷MPP 的常用指標，當機體被感染時，CRP 作為急性期蛋白具有較高的敏感性，CRP、PCT 在短時間內迅速上升[21]。Pearson 相關性分析結果顯示，TIPE2 與Th17、Th17/Treg、CRP、PCT 呈負相關，與Treg、IL-35、FEV1、FVC、PEF 呈正相關，表明TIPE2 可能反映MPP 患兒肺功能狀況，其水平變化與MPP 患兒免疫狀態、病情嚴重程度有關。一般多因素Logistic 回歸分析結果顯示，TIPE2、Th17/Treg、IL-17 是影響MPP 發生的獨立危險因素，表明TIPE2 水平降低、Th17/Treg 失衡加大MPP發生的風險。

綜上所述，MPP 患兒外周血單個核細胞TIPE2水平明顯低于健康兒童，急性發作期患兒TIPE2 水平低于恢復期，Th17 增加，Treg 減少，Th17/Treg平衡被破壞，其水平變化與MPP 患兒肺功能有關，可能作為MPP 發生的潛在生物學指標。本研究在觀察指標及研究對象上尚存不足，如觀察對象較少導致結果可能發生偏倚，未考慮到不同病情程度患兒各項指標的變化，同時還需在下一步研究中擴大研究范圍，隨訪分析患兒治療前后各因子水平的變化，為臨床治療提供依據。