土壤有效磷測定中二硝基酚指示劑替代研究

姚周麟 吳韶輝 應晶琪 王達萍 林 媚

（浙江省柑橘研究所 318026）

磷元素是農作物的生長和發育過程中必需的大量營養元素之一。橘園土壤有效磷是土壤養分的一個重要指標及磷肥施用量的參考指標，其可用于更好地指導柑橘果園的生產管理。目前土壤有效磷測定方法有全波長酶標儀法[1]，吸收光譜測量法[2]，高光譜法[3]，Olsen法[4]等。本實驗室主要采用行業標準（NY/T1121.7-2014）吸收光譜法，該法中將土壤分為酸性土壤（pH＜ 6.5）和中性、堿性土壤（pH≥ 6.5）并采用不同試劑進行提取。柑橘園土壤pH分級標準為pH＜ 4.5（強酸性），4.5～ 5.5（酸性）， 5.5～ 6.5（弱酸性）， 6.5～7.5（弱酸至弱堿性），＞ 7.5（堿性） 5 級。其中pH 4.5～ 5.5和 6.5～ 7.5基本適宜柑橘生長，pH 5.5～ 6.5的弱酸性土較適宜柑橘生長[5]。研究表明，大多數的柑橘產區土壤為偏酸性，如云南玉溪[5]、湖北夷陵區[6]、湖北丹江口市[7]、三峽庫區[8]、重慶市[9]、廣西[10]等[11]，適用此法來進行測定。

在對酸性土壤有效磷的測定中，需要用到二硝基酚指示劑來調節酸堿度，以獲得更好的顯色效果。而二硝基酚（ 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚，如圖 1）有較強的健康危害，致突變性、DNA抑制和生殖毒性，成人口服致死量約1 g，可通過吸入、食入、經皮膚等途徑吸收。同時，二硝基酚又具有危險特性，遇火種、高溫、摩擦、震動或接觸堿性物質、氧化劑時均易引起爆炸，已被列入公安部確定、公布的《易制爆危險化學品名錄》，很多廠家已禁售，購買非常困難。因此，有必要開展該檢測法中二硝基酚的替代指示劑研究。

圖1 2,4-二硝基酚和 2,6-二硝基酚結構圖

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為浙江省柑橘園 0～30 cm土壤，過 2 mm篩孔風干。

1.2 儀器設備

電子天平（AR1502CN），臺式恒溫振蕩器（THZ-D），紫外可見分光光度計（UV-2600）,數顯恒溫水浴鍋（GHH- 6）等。

1.3 試劑配置

1.3.1 二硝基酚指示劑：稱取 0.20 g 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚溶于100mL水中。甲基橙指示劑：稱 0.10 g甲基橙溶于100mL脫鹽水中，搖均即可。

1.3.2 磷標準溶液（ 5 mg/L）和鉬銻抗顯色劑參照NY/T 1121.7-2014中的方法。

1.4 方法

浸提：稱取 5.00 g試樣于200mL塑料瓶中，加入氟化銨-鹽酸浸提劑50.00mL，振蕩30min（180±20r/min），立即用無磷濾紙干過濾。

二硝基酚為指示劑測定方法：吸取濾液10.00mL于50mL容量瓶，加入10mL硼酸溶液，搖勻，加水至30mL左右，再加入 2滴二硝基酚指示劑，用硫酸溶液和氨水溶液調節至溶液剛顯微黃色，加入 5.00mL鉬銻抗顯色劑，用水定容至50mL，在30℃恒溫水浴中靜置30min，用 1cm光徑比色皿在波長700nm處，以標準溶液的零點調零后進行比色測定。同時進行空白溶液的測定。

替代指示劑測定方法：其余條件不變，用替代指示劑來調節試液酸堿度。

標準曲線：分別吸取 5mg/L磷標準溶液0.00mL、 1.00mL、 2.00mL、 4.00mL、 6.00mL、8.00mL、10.00mL于50mL容量瓶中，分別按要求加入浸提劑，硼酸溶液，指示劑，顯色劑，并用水定容至刻度，充分搖勻，即得含磷0.00mg/L、 0.10mg/L、 0.20mg/L、 0.40mg/L、0.60mg/L、 0.80mg/L、 1.00mg/L 的磷標準系列溶液。比色參照上述樣品測定方法。

2 結果分析

2.1 替代指示劑的選擇

NY/T1121.7-2014標準中，以 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚用作酸堿指示劑，其變色范圍是pH為 2.4（無色）～ 4.0（黃色）。在替代指示劑的選擇上，盡量要靠近這個變色范圍。根據酚酞、石蕊、甲基紅、溴甲酚綠等常用指示劑的變色范圍，發現甲基橙指示劑較符合條件。甲基橙，又名 4-｛[ 4-(二甲氨基)苯基]偶氮基｝苯磺酸鈉鹽（圖 2），其作為酸堿指示劑，變色范圍是pH為 3.1（紅）～4.4（黃）。

圖2 甲基橙結構圖

2.2 磷標準曲線

采用不同的指示劑調節酸堿，均有明顯的突變點，以甲基橙作為指示劑的試液，突變點為橙紅色至橙黃色。從制作的磷標準曲線（圖3， 4）可以看出，指示劑對吸光度的斜率影響不大，在磷濃度 0.00～ 1.00mg/L范圍內均具有良好的線性，R能達到0.9999。在實際顯色中，以二硝基酚為指示劑調酸堿后，最終顯色為藍色，磷濃度越高，藍色越深（圖5）；而采用甲基橙作為指示劑，顯色會偏紅，磷濃度越低，偏紅越明顯，磷濃度越高，顯色逐漸趨于藍色（圖 6）。

圖3 以二硝基酚為指示劑調酸堿后的磷標準曲線

圖4 以甲基橙為指示劑調酸堿后的磷標準曲線

圖5 以二硝基酚為指示劑的標準溶液顯色效果

圖6 以甲基橙為指示劑的標準溶液顯色效果

2.3 實際樣品及質控樣測定

實驗選擇了12個酸性土樣，及一個有證標準物質GBW07458（pH為 6.14± 0.07），對有效磷含量值進行測定。每個試樣做三個平行樣，測定數據以平均值表示，實驗結果如表 1。以二硝基酚為指示劑和以甲基橙為指示劑測得的實際樣品土壤有效磷含量誤差均已用絕對誤差表示。根據NY/T 1121.7-2014的精密度要求，當測定值＞20 mg/kg，相對相差≤ 5%；當測定值為10～20 mg/kg，絕對差值≤ 1.0 mg/kg；當測定值＜10 mg/kg，絕對差值≤ 0.5 mg/kg，使用兩種指示劑后測得的土壤有效磷結果符合誤差要求。

表1 兩種指示劑在實際樣品和質控樣中的結果比較

GBW07458為土壤有效態成分分析標準物質，作為質控樣，其可驗證試驗數據準確性，能有效地監控試驗過程，控制檢測質量。根據實驗結果，測得的GBW07458有效磷(氟化銨浸提)含量在其標準范圍（32± 4mg/kg）內。

3 結論

經過理論分析和實驗比對驗證，甲基橙可作為二硝基酚的替代指示劑，進行橘園酸性土有效磷的測定。