葡萄柚果醋液態深層發酵特性研究

曹雪丹 方修貴 趙 凱

（浙江省柑橘研究所 臺州 318026）

葡萄柚(Citrus paradisiMacf.)是蕓香科柑橘屬植物，為世界柑橘四大類群(甜橙類、寬皮柑橘類、檸檬來檬類、葡萄柚和柚類)之一[1]。其果實風味獨特，果實多汁，營養豐富，深受消費者喜愛。經過多年的引種栽培，已逐漸在我國形成了一些具有一定種植規模的主栽品種。據分析，每100 g全果含水分89.64 g、蛋白質 0.89 g、脂肪 0.1 g、碳水化合物 9.5 g；鈣18mg、磷17mg、鐵 0.1mg；VB10.06mg、VB20.03mg、VC4 0mg；每升果汁含柚皮苷528～743 mg，可以形成VP，具有清熱退火的功效[2]。而且，葡萄柚汁有助于保持肝臟移植術后患者排斥抑制劑FK506的谷值濃度，提高其生物利用度[3]。對中國主栽的 9個葡萄柚品種的酚類物質組成及其抗氧化活性研究發現，葡萄柚不僅多酚含量極其豐富，而且抗氧化能力也高[4]，是具有良好開發前景的天然抗氧化劑和保健食品原料。

果醋是以水果或水果加工下腳料為主要原料，經微生物酒精發酵、醋酸發酵釀制而成的一種營養豐富、風味優良且具有抑菌，抗氧化，緩解疲勞，預防飲食型肥胖和高脂血癥等生理功能的酸性調味品[5]。我國傳統釀醋多采用混合菌緩慢發酵的固態工藝，生產周期長達 3個月，勞動強度大，生產成本高。采用液態發酵法生產果醋具有易操作管理，規模化標準化生產，有利于縮短生產周期[6]。近年來，柑橘類果醋的研究報道大多針對菌種的篩選和發酵工藝的優化等方面。如：劉青娥等[7]以自然酸發酵的柑橘醋液為菌源，篩選出41株醋酸菌，其中 1株耐溫性能和耐酒精能力均優于對照菌株滬釀 1.01；程世春[8]從水果中分離得到 1株高產醋酸菌株可用于常規液體發酵法釀造柑橘果醋；王彥安等[9]采用Box-Behnken設計進行柑橘果醋的酒精發酵和醋酸發酵工藝的響應面優化，得出酒精發酵參數為：初始糖度為16%、接種量為5%、初始pH為 3.5，醋酸發酵參數為:接種量為 8.52%、初始酒精度為 6.02%、發酵pH為3.3，該工藝下醋酸產量53.11g/L；曹雪丹等[10]對椪柑果醋液態發酵工藝進行了優化，并經GC-MS分析鑒定出了66種揮發性物質。

但是，目前對液態深層法發酵葡萄柚果醋的研究并不多見。本試驗以滬釀 1.01醋酸桿菌為研究對象，以葡萄柚為研究試材，對液態深層發酵工藝及發酵特性進行研究，以期為葡萄柚及柑橘類果醋的工業化發酵提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄柚采自浙江省柑橘研究所山地試驗站。高活性釀酒干酵母（RV171）：安琪酵母股份有限公司。醋酸菌（滬釀 1.01）：上海迪發釀造生物制品有限公司。白砂糖，偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）等均為食品級；氫氧化鈉（NaOH）等常規試劑均為國產分析純；聚醚砜濾膜（孔徑 0.45μm）：美國密理博公司；果膠酶（活力10萬u/ml，液體型）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；醋酸菌分離培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器

PAL- 3手持式數字折射儀（日本ATAGO公司）；MJ-176NR榨汁/攪拌機（日本松下電器產業株式會社）；SW-CJ- 1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；ZHWY-2102 C恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）； 5 L試驗型自吸發酵罐（南京匯科生物工程設備有限公司）；雷磁JPB-607 A便攜式溶解氧測定儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；FlveGo F2便攜式pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Heal Force HF-151二氧化碳恒溫培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；XK97-A菌落計數器（杭州齊威儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程。挑選大小均勻、成熟度一致的新鮮葡萄柚為原料→用自來水流水沖洗果皮后自然晾干→手工剝皮、去籽→將果肉投入榨汁機中破碎取汁→收集果汁并添加 0.5‰果膠酶，常溫（20℃）酶解→添加焦亞硫酸鈉30～50mg/L并經100目尼龍紗網粗濾→添加活化后的酵母菌200～400mg/L →常溫（20℃）酒精發酵 5～ 7 d→低溫（ 8℃）靜置48 h以上→吸取上清液移入液態發酵罐，測得酒精含量為 4%，添加酵母提取物5‰、葡萄糖 8‰，升溫至36℃后接種滬釀1.01醋酸菌 4‰→調整發酵罐轉子轉速≥1000rpm，醋酸發酵→澄清→過濾→灌裝→滅菌→成品。

1.3.2 醋酸菌分離計數。平板涂布法。稱取醋酸菌分離培養基55.0 g，用1000ml蒸餾水加熱溶解，分裝并于116℃高壓滅菌20min，冷卻至50℃再加入 3%無水乙醇，搖勻后倒入培養皿，待用。準確吸取發酵液 1ml，迅速在無菌環境下按梯度稀釋至109倍，每個梯度吸取 0.1ml接種至培養基上，并用涂布棒快速涂勻，30℃恒溫培養箱中倒置培養48 h，培養結束后觀察培養基顏色的變化和菌落形態，記數。

1.3.3 溶解氧測定。參考HJ 506-2009[11]采用電化學探頭方法。

1.3.4 pH。采用pH計直接測定。

1.3.5 滴定酸。采用酸堿測定法測定。

2 結果與分析

由圖 1可以看出，滬釀 1.01醋酸菌在葡萄柚果醋發酵過程中的活菌數變化具有先升高后降低的趨勢。在發酵初始階段，醋酸菌計數為 5.6 2 log CFU/mL，此后的48 h內進入快速增殖階段，醋酸菌數量最大值達10.7 3log CFU/mL，之后維持在 9.0 log CFU/mL水平并有所下降。通常情況下培養 1 d后為醋酸菌的增殖過程，此時酒精消耗量很小，產酸量并不明顯。培養 2 d后，醋酸菌進入代謝旺盛階段，醋酸菌數量增加不再明顯，此時產酸速度加快。一般培養 4～ 5 d即可達到產酸量的最大值。

圖1 葡萄柚醋發酵過程中醋酸菌計數的變化

由圖 2可以看出，在葡萄柚果醋發酵過程中溶解氧含量的變化呈下降趨勢。在發酵24 h內，發酵液中溶解氧含量呈急速下降的趨勢，由 8.0mg/L下降至 0.5mg/L，之后一直維持在較低水平。這可能是因為滬釀 1.01醋酸菌在葡萄柚果醋發酵初始階段快速增殖，需要消耗大量氧氣。至整個發酵階段，醋酸菌對氧氣的需求量一直較高，這可能是測得發酵液溶解氧含量較低的原因之一。

圖2 葡萄柚醋發酵過程中溶解氧量的變化

由圖 3可以看出，在葡萄柚果醋發酵過程中pH值呈降低趨勢。相比醋酸菌種子培養液（由酵母提取物 1.0%、葡萄糖 4.0%、酒精 4.0%等配制）的pH值≥ 6.5而言，葡萄柚汁的pH值較低，發酵初始階段僅為 4.0左右，可能會對醋酸菌的增殖速度和產酸能力造成影響。但是最終pH值降低至 3.6左右，接近一般食醋pH值 3.2～3.5水平。

圖3 葡萄柚醋發酵過程中pH值的變化

由圖 4可以看出，葡萄柚果醋發酵過程中滴定算含量呈增加的趨勢。由發酵初始階段滴定酸含量 0.5%至發酵96 h后達 2.4%。按照初始酒精度 4%計算，理論最大產酸量也為 4%。但是考慮深層發酵罐攪拌、通氣過程中造成約30%左右的酒精逃逸損失，實際的理論產酸量約為2.8%，則產酸率達到85.71%。提高發酵初始酒精度對產酸率的影響尚待進一步研究。

圖4 葡萄柚醋發酵過程中滴定酸含量的變化

3 結論

醋酸發酵是果醋生產的重要階段，發酵方法的選擇決定了果醋的發酵風味、發酵效率，而醋酸菌菌種對果醋品質的影響較大。近年來，關于柑橘果醋發酵菌種的篩選研究時有報道，但是能否適應液態深層發酵工藝尚不明確。本實驗結果表明，滬釀 1.01醋酸菌可用于液態深層發酵法釀制葡萄柚果醋，48 h內為該醋酸菌的快速增殖期，發酵96 hpH值為 3.6，可滴定酸含量 2.4%。但還需進行果醋發酵工藝條件的優化，為液態深層發酵柑橘類果醋的應用研究提供一定的理論參考，以促進柑橘果醋的工業化生產。