銀質針對大鼠肩袖岡上肌骨-肌腱結合部位損傷的修復作用

趙智龍,丁國萍,胡 媛,王芙蓉,馬維斌,時 沛,歐陽簽

肩袖是維持肩關節穩定和活動的主要解剖結構，肩袖損傷可導致肩關節疼痛與功能障礙，嚴重影響患者的生活及工作質量[1-2]。隨著人口老齡化加劇，肩袖疾病逐漸發展已成為人們一種主要的醫療和經濟負擔[3]。岡上肌為肩袖的結構組織之一，也是最易受損的肩袖肌結構[4]。西醫治療肩袖損傷的方法以消炎止痛、關節鏡等為主，但存在只緩解癥狀并不能醫治其根本，毒副作用較多，手術收費昂貴且術后并發癥嚴重等不足[5]。傳統醫學認為肩袖損傷是由于風寒痹阻、氣滯血瘀后不通則痛而發病，治療時應祛風散寒、活血化瘀、疏通經絡。研究發現，針灸推拿在治療肩袖損傷方面具有一定的優勢[5]。銀質針療法是一種經改良后的特殊針灸療法，在臨床上多用于治療各種原因導致的疼痛，具有消炎止痛的功效[6]。但關于銀質針對肩袖岡上肌損傷的研究卻少有報道，因此，本研究通過構建SD大鼠肩袖岡上肌骨-肌腱結合部位損傷來模仿人體肩袖岡上肌損傷，采用銀質針進行修復治療，觀察其效果，以期為銀質針治療肩袖損傷提供一定的基礎研究資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究于2019年12月-2020年1月在武漢華聯科生物技術有限公司進行。選擇39只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量180～220 g，來源于遼寧長生生物實驗動物中心，動物合格證號：1107261911000185。實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104，飼養環境：溫度為22～26 ℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2 試劑與儀器：戊巴比妥鈉購自Sigma(貨號：P3761)；蘇木精、伊紅染液購自北京雷根生物技術有限公司(貨號：DH0010、DH0045)；大鼠白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司(貨號：RA20607、RA20035)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號：A003-1、A001-1)。0.30×40無菌銀質針購自北京科苑達醫療用品廠；微型電鉆購自韓國世新；石蠟切片機購自杭州艾普儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模：將39只SD大鼠分為3組，其中正常組3只，模型組18只，治療組18只。正常組大鼠進行正常飼養，模型組和治療組大鼠均構建肩袖岡上肌損傷模型：采用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射大鼠進行麻醉，剪除大鼠左肩部毛發，在肩胛骨下緣切2～3 cm橫行皮膚切口，顯露出肱骨頭。將岡上肌腱骨-肌腱結合部位切斷，用微型電鉆在原岡上肌附著處建立2個平行的骨性隧道，采用縫合線穿過骨道將岡上肌腱縫合在原位[7]。逐層縫合切口后，進行正常飼養。治療組在造模后第12天開始進行銀質針治療：采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位放置于手術板上，前肢屈曲放于頭兩側，左肩關節近肱骨頭區均勻涂抹耦合劑，避開皮膚切口處，給予銀質針治療，1周治療1次。分別于治療1、2、4周后選取大鼠(正常組1只，模型組6只，治療組6只)，采用戊巴比妥鈉過量麻醉致死，收集大鼠左肩骨-肌腱結合部位組織，進行組織學觀察及實驗檢測。

1.3.2 HE染色:將骨-肌腱結合部位組織浸泡于5倍體積的脫鈣液中，置于搖床上振蕩，每天更換1次脫鈣液，脫鈣結束后，流水沖洗骨組織24 h。將骨組織縱切并放置于包埋盒中包埋，切出厚度為3 μm的切片水浴中展開。將組織切片脫蠟至水，水洗1～2 min，加入蘇木精染液染色5 min，流水沖洗。加入促藍液返藍5 s，流水沖洗，加入0.5%伊紅染液染色3 min，蒸餾水沖洗。加入梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后進行中性樹脂封片。

1.3.3 ELISA檢測:稱取0.1 g大鼠骨-肌腱結合部位組織于離心管中，加入0.9 mL PBS，充分勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液。將標準品進行梯度稀釋，向酶標包被板標準品孔中加入50 μl標準品，待測孔中加入40 μl上述樣本上清液，再加入10 μl抗體。加入50 μl酶標試劑，室溫孵育30 min，洗滌5次。加入顯色劑，室溫避光顯色10 min，加入50 μl終止液。酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度(OD值)，根據標準品濃度計算出標準曲線的直線回歸方程式，計算待測樣品的實際濃度。

1.3.4 生化檢測：稱取0.1 g大鼠骨-肌腱結合部位組織于離心管中，加入0.9 mL PBS，用手持勻漿器將樣本充分勻漿，以2 500 r/min離心10 min，取上清液待測。根據試劑盒說明書配制試劑進行實驗檢測，計算上清液中MDA濃度及SOD活性水平。

2 結果

2.1 組織形態觀察:觀察各組大鼠左前肢活動情況，模型組大鼠前2周的活動情況均較差，左側前肢上舉無力，或不能上舉、外展，嚴重者有肩部不穩感，第4周逐漸恢復正常；治療組大鼠經過第1周治療后，前肢活動情況出現好轉，第2周活動恢復正常。采集骨-肌腱結合部位組織觀察，與正常組比較，模型組和治療組損傷愈合處瘢痕增生。隨著時間的增加，模型組和治療組骨-肌腱結合部位損傷愈合處瘢痕增生均減輕，與模型組相比，同一時間段的治療組瘢痕增生得到緩解。

2.2 HE染色結果比較：正常組大鼠組織中肌腱纖維、軟骨以及骨組織層次清楚，呈典型的骨腱結合部組織狀排列，而模型組組織細胞排列紊亂，且有炎性細胞浸潤，治療組隨著治療時間的延長，組織病理變化得到改善，細胞排列逐漸恢復正常，炎性細胞浸潤減少。

2.3 深化實驗檢測結果比較：與對照組比較，模型組大鼠骨-肌腱結合部位組織IL-6、TNF-α和MDA水平均顯著升高(P<0.05)，而SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組骨-肌腱結合部位組織IL-6、TNF-α和MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。與第1周治療組比較，第2周治療組IL-6、TNF-α和MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)；第4周治療組IL-6、TNF-α和MDA水平顯著降低(P<0.05)，見表1，說明銀質針治療效果存在一定的時間依賴性。

表1 大鼠骨-肌腱結合部位組織IL-6、TNF-α、MDA和SOD水平比較

3 討論

有研究報告肩袖損傷占肩關節患者的40%～60%[8-9]，而岡上肌是肩部力量集中的交叉點，為肩袖中受力最大的部位，因此極易受損[10]。肩袖損傷發病率隨著年齡的增長而增加，口服藥物或局部封閉等保守治療對于老齡化嚴重的肩袖損傷所造成的弊端也更加明顯[11]。針灸具有疏通經絡、調和氣血的作用，也可改善局部組織微環境，亦能抑制炎癥，進而達到緩解疼痛的作用，對于“筋脈不通、氣血凝滯”的肩部疾病具有較好的治療效果[12]。郭長利等[13]研究發現，針灸配合物理康復鍛煉對肩袖損傷的疼痛緩解以及功能恢復是有效的，且未發生并發癥。王延武等[14]臨床研究結果顯示，電針配合Mulligan動態關節松動術對肩袖損傷后的肩關節疼痛具有很好的改善作用，治療過程中也無不良反應出現。仉樂[15]的研究數據也說明了針灸、推拿配合理療對于運動性肩袖損傷的治療效果更優于單純的理療。這些臨床報告提示針灸對于肩袖損傷具有令人滿意的臨床療效，但缺少相應的基礎研究。銀質針療法是一種特殊的針刺手法，可松解軟組織，刺激痛點，從而達到消炎止痛的作用[6]。本研究采用銀質針治療大鼠左肩袖岡上肌損傷，改善了大鼠的左前肢活動情況，緩解了大鼠骨-肌腱結合部位瘢痕增生，且組織結構變化也得到了恢復，炎性細胞減少，提示銀質針對肩袖岡上肌損傷具有較好的治療效果。

肩袖損傷的發病機制較多，其中包括炎癥反應，炎癥可使肌腱結構發生變化，使肌纖維排列紊亂[16]。郭銳等[17]發現肩袖損傷大鼠的關節液中炎癥因子出現過度表達，當炎癥因子逐漸減少時，疼痛逐漸減輕，而IL-6、TNF-α等炎癥因子與關節疼痛呈正相關，因此認為這些炎癥因子水平可作為肩袖損傷疼痛診治以及療效評價的客觀依據。也有觀點認為，疼痛在一定程度上是氧化應激和炎癥所導致的結果[18]。MDA為氧化應激標志物之一，SOD可抑制氧化應激所引起的炎癥反應[19]，但關于氧化應激在肩袖損傷中的影響卻研究較少。本研究在檢測銀質針對肩袖損傷大鼠炎癥反應影響的同時，也觀察了氧化應激指標MDA及SOD，發現肩袖損傷大鼠骨-肌腱結合部位組織的IL-6、TNF-α和MDA水平均顯著升高(P<0.05)，而SOD活性減低(P<0.05)，說明肩袖損傷大鼠的炎癥反應以及氧化應激水平均出現升高；經過銀質針的治療后，大鼠骨-肌腱結合部位組織的IL-6、TNF-α和MDA水平降低，SOD活性升高(P<0.05)，且隨著治療次數的增加，治療時間的延長，大鼠IL-6、TNF-α和MDA水平越低(P<0.05)，提示銀質針治療可緩解肩袖損傷大鼠的炎癥反應及氧化應激。

綜上所述，銀質針治療可改善肩袖岡上肌損傷大鼠的肢體活動情況以及組織病理變化，這一治療作用可能與抑制大鼠炎癥反應及氧化應激水平有關，有待進一步研究。