腦膠質瘤中TERT啟動子突變分析及預后研究

劉曉莉，屈玉玲，翟學鋒，楊治花

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，其發生發展涉及多種不同的遺傳學改變[1-2]，其中端粒酶逆轉錄酶(TERT)主要通激活端粒酶的活性來維持端粒的完整性，使真核細胞獲得無限增殖能力，在正常細胞內表達量低。全基因組關聯研究發現,TERT啟動子(TERTp)突變與各種腫瘤中mRNA表達獲端粒酶活性的增加有關。TERT在大腦膠質瘤中存在較高表達率，主要歸結于TERT啟動子區2個體細胞點的突變，即C228T和C250T 2個位點，總體突變率約為55%，導致TERTp的轉錄活性增加[3-4]。已有研究表明,TERTp突變可以作為原發性膠質母細胞瘤不良的獨立預后因子，亦可作為該類型較為特異的診斷標志物。除此之外，在低級別膠質瘤中，TERTp與染色體1p/19q聯合缺失密切相關[4]。本研究基于彌漫性膠質瘤的組織病理特征，檢測不同級別及亞型膠質瘤石蠟組織中TERTp突變情況，并結合隨訪資料探討TERTp狀態與不同亞型膠質瘤患者預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集寧夏醫科大學總醫院神經外科2013年6月-2018年9月手術切除并經病理診斷為彌漫性膠質瘤(WHOⅡ-Ⅳ級)的石蠟標本88例，臨床及病理資料情況見表1。

1.2 檢測方法

1.2.1 石蠟標本提取基因組DNA:采用QIAGEN 公司DNA 提取試劑盒(69505)，嚴格按照試劑盒說明書的要求進行操作，并采用紫外分光光度計進行質檢提取DNA濃度(10 ng/μl≤濃度≤100 ng/μl)。

1.2.2 TERT啟動子區突變檢測:①從樣本 DNA 液中取出 3 μl加至測序反應液1中，予以42 ℃ 5 min、94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(進行20個循環)擴增；② 取出 TERT 測序反應液2,GC PCR MIX3，按照上述步驟及條件進行10個循環進行擴增，再取5 μl PCR擴增產物，加入 2 μl SAP混合物混勻,予以 37 ℃ 60 min、80 ℃ 15 min 進行酶解；③取以上酶解產物3 μl、測序試劑 1μl和測序引物2 μl 進行PCR擴增，條件為96 ℃ 1 min,96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min(25次循環),恒溫4 min后將產物進行提純;④將提純的產物置于基因分析儀上測序，使用測序分析軟件 Chroma 2.0分析數據。

1.3 隨訪:通過查閱病歷資料、電話咨詢、門診隨訪等方式，對所有患者進行隨訪，記錄患者生存時間。隨訪截止日期2019年9月30日，隨訪時間0.9～97.3個月，平均28.4個月。

1.4 統計學方法:采用SPSS 19.0統計軟件，用Fisher精確概率法判斷TERTp突變與臨床病理指標的相關性，用Kaplan-Meier法分析TERTp突變與膠質瘤患者預后相關性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TERTp突變在彌漫性膠質瘤發生情況:本組88例彌漫性膠質瘤，TERT啟動子C228T或C250T突變發生率為63.6%,其中WHOⅡ級占51.4%、Ⅲ級占65.0%、Ⅳ級占74.2%。進一步分析發現，少突膠質細胞來源腫瘤(包括少突膠質細胞瘤和間變型少突膠質細胞瘤)和膠質母細胞瘤中有較高的突變率，分別為61.5%、66.7%和74.2%，見圖1(目錄后)。

2.2 TERT啟動子突變與各臨床病理指標的相關性:在本組膠質瘤標本中，TERTp突變(包括C228T和C250T)與患者的年齡(P<0.05)、腫瘤增殖指數呈顯著正相關性(P<0.05)，與彌漫性膠質瘤IDH-1突變蛋白表達呈顯著負相關性(P<0.05)，與患者術后是否復發也有相關性(P<0.05)，差異具有統計學意義；而與患者的性別、膠質瘤WHO分級之間差異無統計學意義，見表1。

表1 TERT啟動子區突變與膠質瘤患者臨床病理指標的相關性分析

2.3 TERT啟動子突變與患者生存時間相關性分析:88例膠質瘤患者Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TERTp突變患者術后生存時間顯著低于野生型(P<0.05)。根據膠質瘤起源，將膠質瘤分成星形細胞起源的膠質瘤和少突膠質細胞起源的膠質瘤單獨分析，發現TERTp突變在星形細胞源性腫瘤組中與患者的不良預后密切相關(P<0.05)，而在少突膠質細胞源性腫瘤組中與患者術后生存時間無顯著相關性(P>0.05)。在老年組中(年齡≥45歲)，TERTp突變患者的生存時間與野生型患者生存時間差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

TERT是端粒酶其中的催化亞單位，當TERT啟動子區發生微小遺傳學改變時，轉錄因子的結合序列發生改變，從而增強了TERT轉錄活性，避免了細胞衰老死亡，促進腫瘤的發生發展[4]。TERTp突變最先于黑色素瘤中發現[5]，并證實在膠質母細胞瘤中突變頻率較高。本研究對88例彌漫性膠質瘤進行TERTp突變點檢測，檢測結果TERTp突變在膠質瘤中總發生頻率為63.6%，在31例膠母中的發生頻率為74.2%，與Killela研究組報道的74.2%[6]和83.9%[7]基本一致。同時研究分析發現，TERTp突變在少突膠質細胞瘤和間變型少突膠質細胞瘤中突變率較高，分別為61.5%和66.7%；而在星形細胞瘤中突變率僅36.4%。結合TERTp在膠質瘤不同亞型的分布不難發現,除外WHO Ⅳ的膠質母細胞瘤，少突膠質細胞起源的膠質瘤中TERTp突變的比例明顯高于星形細胞起源的膠質瘤(包括彌漫性星形細胞瘤和間變型星形細胞瘤)。這一結果提示TERTp可作為彌漫性膠質瘤分型的一個分子指標。再分析其他臨床病理學指標與TERTp突變的相關性發現，在45歲及以上的人群組中，發生TERTp突變的膠質瘤患者明顯多于未發生突變者(34∶8)，而在45歲以下的群體中無顯著差異性，歸因于本研究中原發性膠質母細胞瘤患者多為老年人，而TERT啟動子突變主要集中在該亞型中。本研究還提示，TERTp突變與腫瘤增殖指數呈顯著正相關性，即增值指數而與彌漫性膠質瘤特征性分子標志物IDH-1蛋白表達呈負相關性。IDH-1陰性組中TERTp突變數明顯高于野生型，主要是由于大部分膠質母細胞瘤病例富集于IDH-1表達陰性組中，而膠質母細胞瘤中TERTp突變率高達74.2%。單純依據膠質瘤WHOⅡ-Ⅳ分級因素，結果顯示TERTp突變率隨著膠質瘤級別的遞增略有升高，這種趨勢可能與TERTp突變增加了膠質瘤的惡性表型有一定關系。

Kaplan-Meier生存分析顯示，突變型患者術后生存時間顯著低于野生型患者的生存時間(P<0.05)，與國內外學者報道較一致[6-11]。隨后進一步分組分析發現，TERTp突變在星形細胞源性腫瘤中與不良預后密切相關，而在少突膠質細胞源性組中二者并無相關性。因此可以認為，該突變在少突膠質細胞瘤中的突變率雖然相對較高，但并非是預后不良指標；反之，在彌漫性星形細胞瘤到膠質母細胞瘤這一組群，可以作為一個相對特異的預后不良的分子指標。分組預后分析中還發現，在≥45歲的老年患者組中，檢測TERTp突變狀態對預后有更高的指導意義[8]。

目前，TERTp突變作為一個獨立的腫瘤預后指標還存在爭議，尤其在IDH-1野生型的膠質瘤患者中。有研究表明，在術后接受正規放化療的IDH野生型膠質母細胞瘤患者中，聯合檢測 (MGMT)甲基化狀態和TERTp突變可以更精準預測患者的預后；在細化分組中，TERTp突變且MGMT低甲基化患者預后最差，而TERTp野生型伴MGMT高甲基化患者預后較好[11]。結果提示對于膠質瘤患者需要聯合檢測多個基因，對預測生存期具有更優價值。后續研究將納入MGMT、ATRX、TP53、EGFR等熱點分子改變，進行更加精確的分子分型為基礎的預后分析，尋找可能的治療靶點。