TGF-β對C-28/I2人軟骨細胞聚集蛋白聚糖硫酸化修飾的影響

羅明秀,馬海江,張 甜 ,田 嫁,李正正,陳靜宏,曹峻嶺

骨關節炎(OA)是一種慢性、退行性關節疾病，以關節基質崩解、軟骨細胞的明顯減少為主要特性，但也存在滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨硬化等特征[1]。根據統計，全球OA的發病率在過去的近30年里增長了近20倍，并呈現出一定的年齡和性別特點[2]。研究表明，OA患者軟骨細胞的細胞外基質(ECM)較正常人顯著減少，ECM減少可使細胞生存環境及生存信號喪失而導致軟骨細胞發生凋亡[3]。多聚蛋白聚糖(AG)是分布在關節軟骨ECM中最主要的蛋白聚糖之一，它和膠原是構成ECM的主要生物大分子，在維持ECM組織結構和細胞調節機制方面起著很重要作用。AG含有大量的酸性基團，尤其是SO42-可吸納大量的水分，以保證軟骨的黏彈性以及抗壓能力[4]。研究表明，正常關節軟骨中硫酸酯酶表達較低且局限于軟骨表層，而OA軟骨硫酸酯酶mRNA和蛋白水平升高，可能引起蛋白聚糖硫酸化修飾及生長因子活性改變，從而導致OA軟骨細胞活性異常和軟骨基質降解[5]。轉化生長因子β(TGF-β)信號在軟骨的內穩態平衡與修復中有關鍵性的作用[6-7]，在OA樣的關節退行性改變中都與TGF-β信號通路有關[8]。引起OA的因素有很多，但目前仍缺乏有效的干預措施來阻止或減緩OA的發展進程。因此，本研究以C-28/I2人軟骨細胞系為研究對象，構建TGF-β1慢病毒載體，觀察TGF-β1降低后軟骨蛋白聚糖硫酸化修飾相關酶表達的情況，旨在探討骨關節病的病因和可能的發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:C-28/I2人軟骨細胞系由美國康乃爾大學Mary B.Goldrin 教授惠贈。GV-248質粒(上海吉凱基因化學技術有限公司)，胎牛血清(鼎國,北京)，胰酶(Gibco，美國)，DMEM-F12培養基(HyClone,美國)，引物(上海吉凱基因化學技術有限公司)，蛋白提取試劑盒(上海鼎國生物技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ECL發光試劑盒(Thermo,美國)；TGF-β1兔多抗(GeneTex,美國)，PAPSS2兔多抗(Biossion,9030R,中國)，PAPST1單抗(Santa Cruz,517131,美國)，CHST15兔多抗(Abcam,229223,美國)，β-actin單抗(Santa Cruz,美國)，山羊抗兔IgG(CST,7074,美國)，山羊抗鼠IgG(CST,7076,美國)。

1.2 TGF-β慢病毒包裝:設計3個人源TGF-β1基因RNAi靶點，即：TGFβ1-RNAi(17674-2)、TGFβ1-RNAi(17676-1)和TGFβ1-RNAi(17677-1)，用克隆載體GV-248構建重組質粒，測序鑒定篩選陽性克隆。提取質粒進行慢病毒包裝，用目的質粒載體GV-248、病毒包裝輔助質粒載體Helper1.0和Helper1.0共同轉染293T細胞，48 h后收集細胞上清液，加入病毒保存液，充分溶解后以10 000 r/min離心5 min,收集上清液，用熒光法對病毒滴度進行檢測。

1.3 C-28/I2人軟骨細胞的培養:從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速放入37 ℃水浴中，并不時晃動使其盡快解凍。待細胞凍存物完全解凍后以1 000 r/min離心5 min，用75%酒精擦拭凍存管消毒后移至超凈工作臺。吸去凍存液上清液，加入1 mL新鮮的完全培養基重懸細胞，將細胞懸液接種至含有3 mL完全培養基的24 cm2培養瓶中，輕輕晃勻后放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后觀察細胞生長情況，并更換一次新鮮培養液繼續培養。待細胞增殖達80%左右時，加入1 mL專用胰酶消化液(0.05%胰酶+0.02%EDTA溶于500 mL D-Hanks’液中)于37 ℃消化8～10 min后進行傳代培養，保持細胞良好的生長狀態。

1.4 C-28/I2細胞TGF-β1慢病毒感染:將處于對數生長期的C-28/I2人軟骨細胞用胰酶消化后，用完全培養基(10%血清+1%雙抗)制成5×104個/mL細胞懸液，從中取出2 mL細胞懸液接種于6孔板中，繼續培養至細胞量達到20%時再更換成1 mL新鮮培養基，按照感染MOI值80加入TGF-β1慢病毒和HiTransG P感染增強版進行感染。感染后繼續培養16 h后更換為常規培養基繼續培養，72 h后用熒光顯微鏡觀察GFP表達情況并拍照。

1.5 Western-blot檢測慢病毒感染C-28/I2細胞后各指標蛋白的表達:病毒感染C-28/I2軟骨細胞72 h后，用蛋白質提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。然后加入1/5 體積的6×loading buffer混勻，100 ℃金屬浴煮10 min，短暫離心后于-80 ℃溫度下保存備用。各組蛋白樣品按50 μg等量上樣進行10%SDS-PAGE電泳(濃縮膠80 mA,20 min；分離膠120 mA,1 h)；電泳結束，將蛋白轉移到PVDF膜上(4 ℃、300 mA恒流,150 min)。用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1 h，分別加入用封閉液稀釋的抗體，如：兔多抗TGF-β1(1∶2 000)、PAPSS2(1∶1 000)、CHST15(1∶500)和單抗PAPST1(1∶200)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜4次，每次8 min。用封閉液稀釋相應的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)和山羊抗兔IgG(1∶10 000)，室溫下孵育PVDF膜1.5 h，TBST充分洗膜4次，每次8 min。ECL發光，用凝膠成像系統采集圖像并進行灰度值測定。

2 結果

2.1 TGF-β1慢病毒包裝滴度檢測:TGF-β1 3個不同靶點慢病毒RNAi經測序證實全部與目的基因序列相通，對其用293T細胞和GV-248質粒載體包裝后用熒光法測定其滴度，3個不同靶點TGF-β1慢病毒在加病毒10 μl時熒光中GFP表達最強、1 μl時次之，而0.1 μl時最弱。根據此熒光法可測得3種TGF-β1慢病毒的病毒滴度，選取加1 μl時計算得到的病毒滴度為后續試驗的用量。

2.2 TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細胞熒光表達:根據感染預實驗，選取KD1、KD2和KD3即LV-TGFβ1-RNAi(17674-2)、LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)和LV-TGFβ1-RNAi(17677-1)病毒用量，分別為40 μl、40 μl和53.3 μl對C-28/I2人軟骨細胞系進行感染。感染72 h 后，3個不同靶點TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細胞的GFP熒光表達與對照組相比都達到了80%左右且細胞狀態良好，可進行后續實驗。

2.3 TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細胞后TGF-β1、PAPSS2、PAPST1和CHST15蛋白的表達:將3個不同靶點TGF-β1慢病毒感染C-28/I2人軟骨細胞后提取總蛋白進行Western-blot實驗，如圖1所示(目錄后)，相對于NC組，KD1、KD2和KD3 3組中TGF-β1的表達均明顯降低，其中KD2即LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)組TGF-β1的表達降低最為顯著(P<0.05)，故后續只選擇KD2即LV-TGFβ1-RNAi(17676-1)慢病毒感染細胞組的蛋白進行下游相關酶蛋白分子的檢測。相對于NC組，PAPSS2、PAPST1和CHST15蛋白的表達都有所降低，其中PAPSS2降低最顯著(P<0.05)，而CHST15的表達降低不明顯，見圖1(目錄后)。

3 討論

TGF-β是其超家族成員之一，參與調節細胞的增殖、分化、凋亡和細胞外基質的合成等過程，尤其是在軟骨的形成、維持和修復過程中均發揮著重要的作用[9]。TGF-β在人類中有3種結構相似的亞型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，各亞型之間核苷酸序列高度同源并被不同的基因所編碼，其受體有3種形式分別為TβRⅠ型、TβRⅡ型和 TβRⅢ型[10]。研發發現，轉基因小鼠中TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)的失活促進了終端軟骨細胞的分化[11]，而TβRⅡ顯著抑制的小鼠能夠引起OA樣的病理性肥大和骨贅增生等癥狀[12]。研究者在利用小牛關節軟骨原代細胞的相關實驗中發現，TGF-β能夠保護軟骨的機制可能與下游目標分子PAPS 合成酶2(PAPSS2)有關，TGF-β能夠維持軟骨的生物化學和生物力學性能并能夠調節PAPSS2的表達和小鼠關節軟骨中糖胺聚糖的硫酸化水平[13]。進一步研究發現，TGF-β可能通過依賴p38和Smad的信號通路機制，并通過調控PAPSS2基因的表達能夠同時使得SOX9蛋白穩定表達[14]。TGF-β/Smad信號通路參與早期軟骨細胞形成，并在維持軟骨細胞內穩態過程中發揮著重要作用[15]。

PAPSS2、PAPS轉運體1(PAPST1)和N-乙酰氨基半乳糖胺-4,6-硫酸-硫酸轉移酶[CHST15]是軟骨聚集蛋白聚糖AG硫酸化修飾過程中相關的3種酶蛋白因子。我們前期研究發現，這3種酶蛋白因子在大骨節病(KBD)兒童軟骨以及KBD可疑致病因素DON毒素誘導的C-28/I2人軟骨細胞中的表達比正常對照組均顯著降低[16-17]。KBD是一種區別于OA和風濕性關節炎(RA)的慢性、地方性骨關節病[18]，其典型特征包括ECM調節紊亂，基質金屬蛋白酶活性增加，以致組織完整性受損[19]。早期研究發現KBD患者中糖胺聚糖硫酸化代謝異常，表現為KBD患者關節軟骨ECM中硫酸軟骨素糖胺聚糖的表達顯著降低。而在本實驗結果顯示，TGF-β1慢病毒感染C-28/I2細胞后，TGF-β1、PAPSS2、PAPST1和CHST15的表達均較正常組細胞減少，這表明TGF-β在軟骨細胞中有重要作用，且有可能通過調控下游PAPSS2、PAPST1和CHST15的表達來對軟骨ECM的蛋白聚糖硫酸化修飾產生一定影響。

綜上所述，TGF-β對軟骨細胞的保護作用可能是通過調節多聚蛋白聚糖AG硫酸化修飾相關酶PAPSS2、PAPST1和CHST15的表達來實現的，為OA等骨關節疾病的發病機制提供了實驗依據，但具體的信號通路機制還有待更進一步的實驗研究加以證實。