引起舟山地區凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病病原的分離與鑒定

侯巧利，王庚申，謝建軍，施 慧，許文軍

（1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316021）

凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei是我國四大養殖蝦類之首，2019 年該品種養殖產量達181.5 萬t，占我國蝦類養殖總產量的39%以上[1]。“早期死亡綜合征”（early mortality syndrome,EMS）是近年來在東南亞和墨西哥等地凡納濱對蝦養殖場中爆發的一種新疾病，給對蝦養殖業造成重大經濟損失[2-3]。2009 年開始，該病在我國南方的凡納濱對蝦養殖場爆發流行，病蝦嗜睡，出現空腸空胃，肝胰腺顏色發白，部分患病蝦的肝胰腺呈萎縮或腫大等癥狀,該疫病病程短，短時間內死亡率可達80%以上[4-5]。2012 年8 月，亞太水產養殖中心網絡（NACA）根據該疫病導致的對蝦肝胰腺組織病理學特征，正式命名該疫病為急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）[6]。李俊德等[7]研究發現導致對蝦爆發AHPND 的高致病性副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus都攜帶一個70 kb 大小的pVA1 樣質粒，該質粒上的2 個基因pirAvp和pirBvp編碼了2 種毒力蛋白，自然缺乏pir基因或人為敲除pir基因，菌株會明顯失去致病力，證明了毒素蛋白PirAvp和PirBvp是引起對蝦AHPND 的關鍵。最新研究表明，除了副溶血性弧菌攜帶該毒力基因，在其他致病性弧菌中也發現了含pir毒素基因的pVA1 樣質粒，特別是哈維氏弧菌V.harveyi、歐文斯氏弧菌V.owensii和坎貝氏弧菌V.campbellii等[8-10]。

自2014 年開始，舟山多家凡納濱對蝦養殖場苗種在投放后25 d 左右出現規模性的急性死亡現象。病蝦主要表現為蝦殼變軟，體表色素點異常增多，肝胰腺發白萎縮，與已報道的AHPND 臨床病癥相似。2014-2019 年期間，本實驗室從舟山地區臨床發病對蝦肝胰腺中共分離到30 株病原菌，為了探討引起舟山對蝦養殖中引發疑似AHPND 的病原菌流行病學，本研究通過16S rRNA 基因及gyrB、rpoA等基因同源性檢索分析對30 株分離菌進行了鑒定；用Nested-PCR 方法從30 株臨床分離株鑒定出10 株pirABVP陽性菌株，選取5 株代表性菌株，分別進行了毒力基因pirAvp和pirBvp的PCR 擴增分析，同時通過浸泡感染方式，對5 株細菌的致病性開展了初步研究，以期為舟山凡納濱對蝦養殖中病害診斷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用細菌與對蝦

本研究中共使用30 株細菌，為2014-2019 年期間從浙江舟山地區養殖場疑似患AHPND 的凡納濱對蝦肝胰腺組織中分離獲得。

人工感染試驗所用凡納濱對蝦，購自浙江舟山登步某對蝦養殖場，體長約2～4 cm，體重約為（0.88±0.2）g，水溫25～27 ℃，早晚各投喂1 次配合飼料，經pirABVP毒力基因PCR 檢測為陰性后，暫養1～3 d 備用。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購于青島高科園海博生物技術有限公司，TCBS 瓊脂購于杭州濱和微生物試劑有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 購自TaKaRa 公司，實驗所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA 模板的制備與pirABVP基因PCR 擴增

將實驗室甘油保存試驗菌株在TSA 平板上劃線，28 ℃恒溫培養18～24 h，觀察菌株形態以及熒光產生情況。挑取TSA 平板上菌落形態、大小一致的單菌落，使用DNA 抽提試劑盒（Qiagen 公司），按說明書提取30 株細菌的總DNA，作為PCR 擴增的模板。

pirABvp基因PCR 檢測，采用《世界動物衛生組織（OIE）水生動物疾病診斷手冊》第2.2.1 章4.3.1.2.3.1.10（AP4 套式PCR 法）進行AHPND 相關毒力基因pirABvp的PCR 擴增[11]。PCR 擴增反應體系（25 μL）：17.25 μL超純水，2.5 μL 的10×Reaction buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），2.5 μL 模板DNA，上下游引物（10 pmol·L-1）各0.25 μL，0.25 μL Taq 酶。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。

1.2.2 細菌鑒定與篩選

參考文獻[12]設計合成細菌16S rRNA、gyrB 和ropA 基因的通用引物（表1），PCR 擴增方法按照張曉君等[13]及徐加濤等[14]方法進行，PCR 產物經1.5%凝膠電泳檢測后，送往上海生物工程公司進行基因序列測定。運用DNAMAN 7.0 軟件對測序獲得的16S rRNA、gyrB 和ropA 基因序列進行比對分析，確定分離菌株的細菌種類，從pirABVP陽性菌株中篩選出代表性菌株進行后續病原菌致病性分析試驗。

表1 相關功能基因引物序列Tab.1 Primer sequence of related functional genes

1.2.3 菌株特定基因的PCR 擴增

以1.2.1 中提取的DNA 作為PCR 模板，對選取的細菌進行副溶血弧菌相關毒力基因的PCR 檢測，包括分子伴侶蛋白基因groEL、耐熱直接溶血毒素基因tdh、相對耐熱溶血毒素基因trh 和不耐熱溶血毒素基因tlh，同時對pirAVP和pirBVP基因序列進行PCR 擴增及序列測定，引物見表2，PCR 反應體系同1.2.1。

表2 副溶血弧菌相關毒力基因檢測引物Tab.2 Primers for virulence detection of VP-AHPND specific genes

1.2.4 人工感染試驗及組織病理分析

采用不同的浸泡感染方法對健康對蝦進行回感試驗。試驗菌分別在TSA 培養基上進行增菌培養，28 ℃恒溫培養18～24 h，1.5%的無菌生理鹽水洗脫菌苔，重懸于1.5%的無菌生理鹽水中，分光光度計測定菌液在OD 550 nm 下的吸光度值，確定細菌含量。同時取適量菌液涂布TSA 培養基，28 ℃恒溫培養24 h 后計數。

感染試驗分別設置試驗A 組、試驗B 組及空白對照組，各試驗組設置3 個平行，每組20 尾蝦。將60尾健康對蝦在1 L 含2×108CFU·mL-1細菌的海水中浸泡，15 min 后將浸泡后的對蝦轉移到含10 L 養殖水體的試驗缸中；在試驗A 組的養殖水體中加入預先制備的菌液，使菌含量最終為2×106CFU·mL-1；試驗B 組的養殖水體不加菌；對照組采用10 L 海水浸泡，15 min 后轉移到同樣體積的養殖水體中。各試驗組在浸泡期間保持充氧，水溫保持恒定為（26±2）℃，各組早晚各投喂1 次，試驗連續觀察7 d，計算各組累計死亡率。

取瀕死對蝦的肝胰腺和腸道組織固定于Bouin 氏液中，在24 h 后換數次75%乙醇沖洗，最后保存于75%的乙醇中。固定樣品經乙醇系列及丙酮脫水過程，移入二甲苯溶液中透明，浸蠟包埋后切片，烤干后展片以蘇木精-伊紅染色法（H&E）染色，顯微鏡下觀察拍照[15-17]。

2 結果

2.1 細菌pirABvp 基因PCR 檢測結果

30 株菌在TSA 和TCBS 培養基上都生長良好，其中7 株菌在暗視野下可以觀察到顯著的熒光（圖1）。為了確認30 株臨床分離菌是否攜帶pirABvp基因，采用OIE《水生動物疫病診斷手冊》的Nested-PCR 法對細菌株進行了預篩選。結果顯示：30 株細菌中共有10 株菌攜帶pirABvp基因，占比為30%（圖2、圖3）。

圖1 部分菌株黑暗處可觀察到熒光Fig.1 Fluorescence can be observed in darkness of some strains

圖2 AHPND 一次PCR 檢測圖Fig.2 Electropherograms of the first round PCR product

圖3 AHPND 二次PCR 檢測圖Fig.3 Electropherograms of the second round PCR product

2.2 16S rRNA 基因鑒定及細菌篩選

經16S rRNA 及gyrB、rpoA 等基因分析比對結果顯示，30 株試驗菌株中有副溶血弧菌7 株，坎貝氏弧菌8 株，歐文斯氏弧菌7 株；而10 株pirABVP陽性菌株中，有4 株為副溶血弧菌、2 株為歐文斯氏弧菌和5株為坎貝氏弧菌（表3）。從10 株pirABVP陽性菌中篩選出4 株代表性菌株用于后續感染實驗，分別為1 株副溶血弧菌（1406001）、1 株歐文斯氏弧菌（1906001）和2 株坎貝氏弧菌（1509001、1904001），以及1 株坎貝氏弧菌pirAB—（1508001），其中2 株坎貝氏弧菌在暗視野下可以觀察到顯著的熒光。菌株1406001 基因序列與GenBank 中已發布的致AHPND 的高致病性副溶血弧菌（GQ205448）的序列具有99.93%的相似度性；菌株1508001、1509001、1904001 序列與坎貝氏弧菌序列（MT207282）相似度為99.35%；菌株1906001 基因序列與歐文斯氏弧菌序列相似度99.65%。

表3 11 株菌16S rRNA、gyrB、rpoA 序列在GenBank 中同源性最高的基因序列Tab.3 The 16S rRNA, gyrB,rpoA sequence of 11 strains showed the highest homology in GenBank

2.3 細菌特定基因的檢測結果

本實驗中對副溶血弧菌毒力分子標記基因tdh、trh 和tlh 及副溶血弧菌特異性標志基因groEL進行檢測，30 菌株毒力基因檢測結果顯示，7 株副溶血弧菌均攜帶groEL 基因分子蛋白，且含有tlh基因，不攜帶副溶血弧菌臨床毒力基因tdh和trh；其中包括菌株1406001，其它4 株菌對tdh、trh、tlh以及groEL基因PCR擴增結果均為陰性（表4）。

表4 菌株毒力基因鑒定Tab.4 Virulence gene results of bacterial strain

運用BLAST 軟件對副溶血弧菌（1406001）、坎貝氏弧菌（1509001、1904001）和歐文斯氏弧菌（1906001）的pirAVP和pirBVP樣基因的PCR 產物進行序列分析。結果表明，4 株pirABVP陽性菌的pirAVP和pirBVP基因序列之間的同源性為100%，與已報道的副溶血性弧菌質粒的pirAvp和pirBvp樣基因序列（登錄號為MH718270）相比對分析，覆蓋率100%，相似度為100%。根據Nested-PCR 檢測結果以及菌株的pirAVP和pirBVP基因的測序分析結果顯示，該4 株菌被初步確定為可以導致AHPND 的致病菌。

2.4 人工感染實驗結果

參考TRAN,et al[18]的試驗方法，對健康凡納濱對蝦開展人工感染試驗，測定不同菌株的致病性，整個感染試驗周期7 d。實驗期間，對照組對蝦和不攜帶pirAVP和pirBVP基因的菌株1508001 感染組對蝦肝胰腺正常，對蝦攝食和活力正常，未出現死亡；試驗過程中，持續細菌暴露組（試驗A 組）對蝦感染后發病較快，感染12 h 后對蝦活力明顯下降，并出現發病死亡的個體，24～72 h 內死亡對蝦數量急劇增加，最高達85%；試驗B 組對蝦，在感染18 h 后開始出現零星死亡，24～72 h 內對蝦死亡數量緩慢增加，死亡率最高為55%。試驗A 組中，菌株1406001 感染對蝦后，對蝦發病最快，在感染72 h 內死亡率急劇升高，96 h 內實驗組對蝦死亡率高達90%；菌株1904001 感染對蝦后，對蝦發病比較緩慢，在72 h 內死亡率只有50%，見圖4；試驗結果表明4 株菌的毒力有一定差異，環境中高濃度致病菌增加了對蝦死亡率。在感染7 d 后，所有存活的對蝦基本都出現對蝦體表色斑點異常增多，部分對蝦甲殼及須發紅明顯，空腸空胃，腹節肌肉透明度下降，肝胰腺顏色變為淡黃色甚至發白等癥狀（圖5）。

圖4 實驗各組的累積死亡率（平均值±標準差）Fig.4 The cumulative mortality of stains in different treatments（mean±SD）

圖5 感染組與空白組凡納濱對蝦Fig.5 The shrimp infected by the isolated strain and normal L.vannamei

2.5 組織病理學觀察

浸浴感染試驗過程中，取樣瀕死對蝦肝胰腺經石蠟切片和HE 染色制片，進行光鏡下進行組織病理學觀察。結果顯示：對照組對蝦的肝胰腺組織管腔結構完整，可以清晰分辨出吸收細胞、分泌細胞及纖維細胞[19]（圖版I-1）。與對照組相比，攜帶pirABVP的質粒的菌株1406001、1509001、1904001、1906001 感染組對蝦的肝胰腺組織發生嚴重的病理學變化，肝胰腺組織中的管狀結構出現嚴重崩塌，部分功能細胞缺失，血淋巴細胞增多（圖版I-2）；部分肝胰腺小管上皮層變薄，上皮細胞脫落至管腔內（圖版I-3），無法分辨出B細胞、R 細胞和F 細胞，小管中可見大量細菌，且出現大量血淋巴細胞浸潤的現象（圖版I-4）；細胞核也出現腫大（圖版I-5），呈現典型的AHPND 病理學特征。

圖版Ⅰ 凡納濱對蝦的肝胰腺HE 染色組織切片觀察Plate Ⅰ HE-stained histological sections of the hepatopancreas of L.vannamei

腸道組織切片結果顯示，正常對蝦腸道上皮細胞排列緊密，上皮細胞與基膜緊密相連，細胞間隙清晰，腸道內壁向腸腔內形成褶皺[20]（如圖版II-1）。菌株感染后，凡納濱對蝦腸道組織形態出現明顯變化，細胞游離端絨毛脫落，上皮細胞出現細胞核肥大（圖版II-2）；基膜與上皮細胞出現間隙，腸道損傷嚴重則會出現上皮細胞脫落（圖版II-3）；細胞核邊緣模糊不清等癥狀（圖版II-4）。

圖版Ⅱ 凡納濱對蝦腸道組織切片Plate Ⅱ Histological examination of L.vannamei midguts

3 討論

本文對舟山地區2014 年至2019 年期間，疑似發生AHPND 凡納濱對蝦的肝胰腺中分離到的病原菌進行了細菌鑒定。根據16S rRNA、gyrB 及rpoA 等基因序列比對分析結果顯示舟山地區患病凡納濱對蝦肝胰腺中分離到的病原菌主要以副溶血弧菌、坎貝氏弧菌及歐文斯氏弧菌為主，其中有10 株菌攜帶pirABVP毒力基因的菌株，占總比的30%。選取4 株pirABVP陽性菌株進行回歸感染試驗，結果攜帶pirABVP毒力基因的副溶血弧菌、歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌三株試驗菌均可導致健康對蝦發病死亡，且表現的臨床癥狀和組織病理變化與報道的AHPND 相似；但不攜帶pirABVP基因的菌株則對健康對蝦沒有致病性。LIU Liyuan,et al[9]對歐文斯氏弧菌繼代培養研究發現pirAB 基因具有不穩定性，在純培養條件下pirAB 基因往往會丟失，本試驗結果顯示從疑似患AHPND 凡納濱對蝦肝胰腺上分離到的部分病原性弧菌并不攜帶pirABVP毒力基因，是否存在pirAB 基因丟失還有待進一步研究。攜帶pVA1 型質粒的高致病性副溶血弧菌最初被認為是對蝦AHPND 唯一致病菌，但后續研究發現不同物種間pVA1 型質粒發生水平轉移，哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌及歐文斯氏弧菌等弧菌也可攜帶pVA1 型質粒，并引起對蝦發病。本試驗結果顯示，高致病性副溶血弧菌以及攜帶pirAB 毒力基因的歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌是舟山地區養殖凡納濱對蝦爆發AHPND 的主要致病菌。

現有的文獻報道顯示16S rRNA 基因和hsp60、gapA、gyrB、recA、rpoA 等管家基因的PCR 擴增分析是弧菌種類鑒定和系統發育研究分析的主要工具。本文采用16S rRNA 基因，rpoA、gyrB、groEL 等管家基因和tdh、trh、tlh 等毒力基因相結合對弧菌進行了鑒定分類。tdh、trh 和tlh 是致病性副溶血弧菌的重要毒力因子，但TANIGUCHI,et al[21]研究發現副溶血弧菌無論是臨床分離株，還是環境分離株都攜帶tlh 毒力基因。劉杰等[22]對67 株蝦源副溶血弧菌進行tdh、trh 和tlh 毒力基因檢測，結果所有菌株均為tdh～-trh～-tlh～+。本次試驗中共檢出7 株副溶血弧菌，毒力基因PCR 檢測結果顯示，7 株副溶血弧菌均攜帶毒力基因tlh，但不攜帶trh 和tdh 基因。本次實驗中選取了1 株副溶血弧菌進行感染試驗，該菌株不攜帶tdh 和trh毒力基因，但tlh 毒力基因PCR 檢測為陽性；而其它3 株pirABVP陽性非副溶血弧菌試驗菌株經PCR 檢測均不攜帶這3 種毒力基因。感染實驗結果顯示，4 株pVA1 陽性菌株對健康對蝦都有致病性，但是攜帶tlh基因的副溶血弧菌感染組對蝦發病最快，臨床癥狀最明顯，死亡率最高。本次實驗中tlh 毒力基因的存在是否加劇了菌株的致病性還有待進一步研究。

AHPND 是一種嚴重危害對蝦養殖業健康發展的疫病，也是近年來全球對蝦大規模減產的重要細菌性疾病之一[23-25]。對AHPND 最初的研究認為攜帶pVA1 致病質粒的副溶血弧菌是該病的致病菌[26]，但近年來，更多的研究報道證實其它攜帶pVA1 的弧菌也可以引起對蝦AHPND 的發生。DONG Xuan,et al[10]在暴發AHPND 的對蝦肝胰腺中分離到一株坎貝氏弧菌，經PCR 檢測這株弧菌攜帶pVA1 型質粒，感染試驗也證實了這株病原菌具有致對蝦AHPND 的能力；HAN,et al[27]也在患AHPND 的對蝦上分離到攜帶pVA1型質粒的坎貝氏弧菌；目前的研究普遍認為pVA1 型質粒的接合轉移可導致新AHPND 致病弧菌的產生。本次試驗中分離獲得的10 株pirABVP陽性細菌主要以副溶血弧菌、歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌3 種弧菌為主，實驗中鑒定出2 株攜帶pirABVP陽性坎貝氏弧菌，及1 株pirABVP陰性坎貝氏弧菌，而后者對健康對蝦沒有致病性。實驗結果也從側面證實pVA1 型質?？赡馨l生水平轉移，導致了養殖環境中新AHPND 致病性弧菌的產生。

陳曉玲等[28]對中國明對蝦養殖塘中弧菌數量與AHPND 關系開展調查，結果顯示養殖環境中弧菌數量的增多，AHPND 暴發的可能性也會隨之升高。本次試驗中，試驗A 組采用2×108CFU·mL-1高濃度菌液浸泡15 min，再在養殖水體中維持2×106CFU·mL-1菌量進行持續感染，結果副溶血弧菌（1406001）感染組對蝦發病最快，72 h 內即出現大量死亡，96 h 死亡率已高達95%，而其他3 株菌感染7 d 內累計死亡率也分別達95%、75%、90%；試驗B 組采用2×108CFU·mL-1高濃度菌液浸泡15 min，之后對蝦在普通海水中養殖，試驗開始后7 d 內，副溶血弧菌（1406001）感染對蝦累積死亡率為60%、坎貝氏弧菌（1904001）感染對蝦累積死亡率為50%、坎貝氏弧菌（1509001）和歐文斯氏弧菌（1906001）感染對蝦累積死亡率均為55%，試驗結果表明，養殖水體中弧菌持續存在導致對蝦二次細菌感染，致其死亡率明顯高于一次細菌感染。弧菌是一種常見的條件性致病菌，一旦在水產養殖環境中大量滋生，將嚴重危害規?；酿B殖，尤其是當對蝦本身抵抗力降低時，弧菌就會乘虛而入。倪純治等[29]發現當養殖池水中弧菌含量高于海區海水中正常菌含量時，蝦池的發病概率就會升高。目前暫無有效的藥物治療對蝦AHPND，對蝦AHPND 的防治主要還是在對蝦未發病時采取防重于治的防治措施[30]。因此為了預防對蝦AHPND，應定期檢測水體和蝦體中的弧菌數量，盡可能控制水體中弧菌數量，消除傳染源切斷傳染途徑，創造良好的養殖環境，防止其在養殖生產中暴發。