雞飼料中抗生素耐藥菌和耐藥基因污染初探

馮 博,黃柳娟,周昌艷,2,邵 毅,2*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,上海201403;2上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201403)

為控制疾病和提高產(chǎn)量,抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè),但長(zhǎng)期大量使用抗生素會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性,不利于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。2013年我國(guó)抗生素使用總量約為16.2萬(wàn)t,其中獸用抗生素使用量約占52%[1]。起初,抗生素的耐藥性是自然發(fā)生的[2-4],但隨著人類和動(dòng)物誤用抗生素的發(fā)生,其耐藥性的傳播速度不斷加快[5]。我國(guó)作為最大的抗生素使用國(guó),抗生素耐藥菌和耐藥基因的污染問(wèn)題已受到廣泛的關(guān)注[6-8]。

動(dòng)物飼料若被耐藥菌污染,耐藥菌便可通過(guò)喂養(yǎng)的方式進(jìn)入飼養(yǎng)動(dòng)物的消化道。在抗生素的作用下,動(dòng)物腸道中耐藥菌比敏感菌更易增殖,并可在加工、運(yùn)輸、銷售等過(guò)程中污染相關(guān)畜禽產(chǎn)品,最終通過(guò)食物鏈對(duì)人類健康造成威脅[9-10]。因此,從源頭上控制耐藥菌和耐藥基因的污染及傳播具有重要意義。目前,飼料中有關(guān)耐藥菌和耐藥基因的分布情況的研究較少,與抗生素殘留之間的關(guān)系也有待深入探討。本研究通過(guò)收集上海市若干規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)及養(yǎng)殖散戶的飼料樣品,檢測(cè)80種畜禽養(yǎng)殖相關(guān)的抗生素殘留,篩查6種養(yǎng)雞業(yè)常用抗生素的耐藥菌和17種相關(guān)耐藥基因,以期了解雞飼料樣品中抗生素殘留、耐藥菌和耐藥基因的分布情況,以進(jìn)一步明確養(yǎng)殖業(yè)抗生素耐藥性的發(fā)生規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 樣品

飼料樣品采集自上海市金山區(qū)肉、蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)及散戶,包括多種糧食飼料、配合料、自制飼料和食槽飼料(表1)。

表1 采樣信息表Table 1 Sample information

1.2 試劑

頭孢噻肟鈉(Cefotaxime Sodium Salt,Ctx)購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,Cip)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole,Sul)、鹽酸強(qiáng)力霉素(Doxycycline hyclate,Dox)、紅霉素(Erythromycin,Erm)、甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim,Tri)、四環(huán)素(Tetracycline,Tet),購(gòu)自默克生命科學(xué)(上海)有限公司;放線菌酮(Cycloheximide,Cyc)購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司;腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion,BHI)培養(yǎng)基及瓊脂粉(Agar)購(gòu)自英國(guó)OXOID公司;熒光定量PCR相關(guān)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

均質(zhì)機(jī)(法國(guó)Interscience公司),生物安全柜、超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司),培養(yǎng)箱(德國(guó)Friocell公司),熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士Roche公司),臺(tái)式離心機(jī)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司),超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters I-Class UPLC Xevo TQS,美國(guó)Waters公司)。

1.4 方法

1.4.1 抗生素殘留量測(cè)定

選用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)抗生素的殘留量進(jìn)行測(cè)定。

前處理:在2 g樣品中加入10 ml CH3CN∶1%甲酸水[8∶2(v∕v)],渦動(dòng)10 min,超聲5 min,2 000g離心3 min;取2 mL上層提取液過(guò)Waters Oasis Prime HLB Extraction Cartridge小柱,取0.5 mL,加入0.5 mL ddH20,漩渦混勻,過(guò)0.22μm濾膜,裝瓶上機(jī)。

液相色譜條件:Waters BEH C18柱(1.7μm,2.1 mm×100 mm);柱溫:45℃。進(jìn)樣體積:5μL。流速:0.4 mL∕min。A路流動(dòng)相:甲醇;B路流動(dòng)相:10 mmol∕L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液,流速及梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);毛細(xì)管電壓:2.5 kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑溫度:450℃。掃描方式:正負(fù)離子掃描。檢測(cè)方式:多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。霧化氣(氮?dú)?流速:1 000 L∕h;錐孔氣(氮?dú)?流速:150 L∕h;碰撞氣(氬氣)流速:0.11 L∕h。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 2 Mobile phase gradient elution conditions

1.4.2 總菌數(shù)測(cè)定和耐藥菌分離計(jì)數(shù)

參照Huang等[11]從樣品中篩選耐藥菌的方法,結(jié)合美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)樣品中耐Cip、Ctx、Dox、Erm、Sul+Tri、Tet的高抗細(xì)菌進(jìn)行分離。稱量25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水后均質(zhì)3 min。10倍梯度稀釋,每個(gè)濃度吸取100μL菌液涂布于分別含有4μg∕mL Cip、4μg∕mL Ctx、16μg∕mL Dox、100μg∕mL Erm、152μg∕mL Sul+8μg∕mL Tri、8μg∕mL Tet的平板和不含抗生素的BHI平板,所有平板額外添加100μg∕mL Cyc用于抑制放線菌的生長(zhǎng),每個(gè)梯度3個(gè)平行。37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。

1.4.3 耐藥基因的定量分析

參考使用CTAB法[12]提取樣品中的總DNA。收集10 mL樣品的均質(zhì)液,1 000g離心2 min后收集上清,再12 000g離心3 min收集沉淀。向沉淀中加入575μL含2 mg∕mL溶菌酶的TE溶液,重懸后37℃孵育1 h。加入30μL 10%的SDS和15μL 20 mg∕mL蛋白酶K水溶液,混勻后37℃孵育1 h。加入100μL 5 mol∕L NaCl溶液,混勻,加入80μL CTAB∕NaCl溶液,混勻后65℃孵育10 min。加入768μL氯仿和32μL異戊醇,充分混勻后10 000g離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入等體積的酚∕氯仿∕異戊醇[25∶24∶1(v∕v∕v)],充分混勻后10 000g離心5 min。吸取上清至新的離心管中,加入0.7倍體積異丙醇,輕輕混合至DNA沉淀,離心棄上清后用1 mL 70%乙醇洗滌2次。晾干后加入50—100μL預(yù)熱至60℃的ddH2O溶解。

以前期合成的攜帶不同抗性基因的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,使用超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的樣品DNA進(jìn)行定量。目的基因及PCR引物[6]見(jiàn)表3。熒光定量PCR擴(kuò)增條件均為:94℃5 min;94℃30 s,對(duì)應(yīng)退火溫度下30 s,72℃30 s,35個(gè)循環(huán);72℃5 min。

表3 耐藥基因定量PCR引物Table 3 Primer sequence of antibiotic resistance genes

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中抗生素殘留情況

抗生素檢測(cè)結(jié)果顯示,22份飼料樣品中僅從21號(hào)樣品(肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)食槽飼料)檢出了3種抗生素殘留,分別是磺胺氯吡嗪(0.082 mg∕kg),強(qiáng)力霉素(0.005 mg∕kg)和氟苯尼考(0.014 mg∕kg)。且磺胺氯吡嗪及氟苯尼考為《獸用處方藥品種目錄(第一批)》(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1997號(hào))允許用藥,且此次檢測(cè)出的抗生素殘留量遠(yuǎn)低于《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào))中規(guī)定的相關(guān)安全限量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 飼料中耐藥菌分布情況

如圖1所示,22份飼料樣品中總菌數(shù)存在一定的差異,為103—108CFU∕g。除3號(hào)、5號(hào)樣品外,其余樣品均有不同程度的耐藥菌檢出。耐藥菌平均數(shù)較高的為22號(hào)樣品(3.78×107CFU∕g)、2號(hào)樣品(3.6×106CFU∕g)和21號(hào)樣品(2.9×106CFU∕g),3號(hào)、5號(hào)樣品總菌量?jī)H為1.5×103CFU∕g和5.3×104CFU∕g,且未有耐藥菌檢出。

圖1 22份雞飼料樣品中總菌數(shù)及抗生素耐藥菌數(shù)Fig.1 Amount of antibiotic resistance bacteria in 22 chicken feed samples

2.3 飼料中耐藥基因的分布情況

如圖2所示,22份雞飼料樣品中存在不同程度耐藥基因污染,耐藥基因總數(shù)在105—108copies∕g。其中耐藥基因總數(shù)較高的樣品為22號(hào)樣品(9.77×107copies∕g)、15號(hào)樣品(2.77×107copies∕g)和21號(hào)樣品(2.23×107copies∕g)。平均拷貝數(shù)較高的耐藥基因主要有:ermB(9.75×107copies∕g)、tetK(4.33×107copies∕g)和tet32(9.68×106copies∕g)。

圖2 22份雞飼料樣品中16種抗生素耐藥基因污染量Fig.2 Amount of 16 kinds of antibiotic resistance gene in 22 chicken feed samples

為比較耐藥基因污染情況在不同種類樣品中的差異,將22份飼料樣品分為4類:糧食配料、配合料、自制飼料和食槽飼料。如圖3所示,tet類12個(gè)耐藥基因拷貝數(shù)總量和sul2基因的拷貝數(shù)在食槽飼料樣品中最高,且與其他幾類飼料樣品有顯著性差異,糧食配料、配合料和自制飼料之間無(wú)顯著性差異;qnrA基因的拷貝數(shù)在糧食配料中總量最高,且與配合料樣品具有顯著性差異,與其他兩類飼料無(wú)顯著性差異;ermB基因在食槽飼料中拷貝數(shù)最高,與糧食飼料樣品具有顯著性差異;blaC MY-2基因在糧食飼料和食槽飼料中平均含量較高,各組樣品間無(wú)顯著性差異。

圖3 5種耐藥基因在4類飼料樣品中的分布情況Fig.3 Amount of 5 antibiotic resistance genes in 4 types of feed samples

3 討論與結(jié)論

研究表明,養(yǎng)殖業(yè)中獸用抗生素的大量使用不僅帶來(lái)了嚴(yán)重的抗生素殘留問(wèn)題,更使許多細(xì)菌獲得了耐藥性,其他細(xì)菌甚至人類都可成為耐藥基因遷移的受體[13-14],帶來(lái)潛在的耐藥性傳播風(fēng)險(xiǎn)。養(yǎng)殖場(chǎng)[15-17]、屠宰場(chǎng)[18-19]等環(huán)境中耐藥菌和耐藥基因的含量較高,可通過(guò)污染飼料、飼喂動(dòng)物的方式進(jìn)入動(dòng)物腸道定殖,并在屠宰、加工過(guò)程中對(duì)畜禽產(chǎn)品造成污染。在傳播途徑方面,除了常規(guī)的接觸式交叉污染[20]外,氣溶膠遷移污染[21]和耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[22]均可造成耐藥菌和耐藥基因的遷移。因此,本研究主要關(guān)注飼料中抗生素殘留情況、耐藥菌和耐藥基因的分布情況以及兩者之間的關(guān)系。

我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用總量較高的抗生素主要為四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、雙萜烯類、磺胺類抗生素[23],土壤中普遍可檢出四環(huán)素抗生素殘留[24]。本研究多數(shù)樣品中均無(wú)抗生素殘留,僅有1份來(lái)自食槽的飼料樣品中有3種抗生素殘留,且含量符合國(guó)家相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。其中檢出的磺胺氯吡嗪為磺胺類抗生素,氟苯尼考為氯霉素類抗生素,強(qiáng)力霉素為四環(huán)素類抗生素,與前人的研究結(jié)果較吻合。與此同時(shí),樣品(包含未檢出抗生素殘留的樣品)中普遍發(fā)現(xiàn)大量的耐藥菌和耐藥基因。總體來(lái)看,來(lái)自食槽的樣品中的耐藥菌和耐藥基因總量是相對(duì)較高的。不同來(lái)源和種類的飼料樣品中耐藥菌和耐藥基因含量存在一定的差異,如2—4號(hào)均為玉米樣品,但2號(hào)、3號(hào)樣品之間無(wú)論總菌量還是耐藥菌量均存在較大差異,這可能是樣品來(lái)源不同、儲(chǔ)存環(huán)境和狀態(tài)不同所致。耐藥基因方面,所有樣品中tet、sul2和ermB拷貝數(shù)較高,且食槽飼料中tet和sul2基因的含量與其他幾類飼料樣品具有顯著性差異。

雖然抗生素的使用與環(huán)境中耐藥菌之間的關(guān)系已經(jīng)逐漸被探明,但飼料中耐藥菌和耐藥基因的存續(xù)情況仍有待研究。本研究結(jié)果顯示,大多數(shù)飼料樣品中沒(méi)有抗生素的殘留,但有不同程度的耐藥菌和耐藥基因的污染。無(wú)論這些耐藥菌和耐藥基因的來(lái)源為何,以何種途徑進(jìn)入樣品,雞飼料中耐藥菌和耐藥基因的存續(xù)可能并不依賴于抗生素的選擇性壓力。因此,減少抗生素的使用不一定能直接減少耐藥菌和耐藥基因的數(shù)量,在未來(lái)的減抗、無(wú)抗養(yǎng)殖中耐藥菌和耐藥基因仍可能存在并進(jìn)入養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)。