蜘蛛香環烯醚萜類成分對急性脊髓損傷大鼠神經細胞焦亡的影響

王靜怡，尹杰，劉建成，龐日朝，王文春

1.西南交通大學醫學院，四川成都市 610031；2.中國人民解放軍西部戰區總醫院康復醫學科，四川成都市610083

脊髓損傷是一類極具危害的神經系統疾病，生活中常由高處跌落、摔倒和車禍等外界因素造成，一旦發生，會在損傷部位產生瞬間損害，繼而引發損傷節段以下神經感覺傳導受阻或缺失以及運動功能障礙的產生[1-2]。脊髓損傷極高的致殘率，對患者的身心健康、生活質量及其家庭乃至社會帶來嚴重影響[3-4]。同時，脊髓損傷在全世界范圍內發病率較高，每百萬人口中約有10.4～83例[5]。目前臨床上仍未找到適用于脊髓損傷的確切、安全及有效的治療方法[6]。因此，尋找有效的藥物用于脊髓損傷治療意義重大。

中草藥蜘蛛香的應用歷史極為久遠，其環烯醚萜類主要成分已被發現在抗焦慮[7-8]、抗抑郁[9]、抗氧化[10]和神經保護[11]等方面有積極作用。蜘蛛香環烯醚萜類可促進傷后大鼠運動功能的恢復，改善繼發性炎癥反應以及氧化應激等病理程度[12-13]。而對急性脊髓損傷繼發性損害的減輕一直是研究的要點，炎癥反應作為繼發損害的關鍵因素之一，會產生大量促炎因子白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18，以及蛋白酶等加速神經細胞的死亡[14]。焦亡是目前細胞炎性死亡的研究熱門方向，在脊髓繼發性損傷發生后，細胞內外的毒性分子會誘導炎性體的形成，其中報道較多的炎性小體是NLRP3，一旦被激活可觸發下游分子的活化，引發細胞焦亡，釋放更多的炎性因子，放大炎癥效應[15]。蜘蛛香環烯醚萜類在脊髓損傷后對繼發性炎癥的抑制，是否與減輕神經細胞焦亡有關是個值得探討的問題。

本研究旨在觀察蜘蛛香環烯醚萜類在急性脊髓損傷后對神經細胞焦亡的影響，以發現該藥物在神經保護方面的更多可能機制，為蜘蛛香藥物在脊髓損傷的臨床應用提供更多基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Sprague-Dawley 大鼠24 只，體質量250～280 g，購于成都達碩生物科技有限公司，動物生產合格證號SCXK(川)2015-030。保持飼養環境清潔及通風，室溫(22±2)℃，空氣相對濕度為60%，12 h 明暗交替，自由飲食。

隨機數字法將大鼠分為假手術組、模型組和治療組，每組8只，每籠4只分籠飼養，適應性喂養1周后造模。本實驗所有操作均遵循中國人民解放軍西部戰區總醫院倫理委員會的相關標準。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1蜘蛛香藥物

于貴州省遵義市藥材市場進行采購，由西南交通大學生命科學學院宋良科副教授鑒定為蜘蛛香藥材，儲存在陰涼通風處[16]。

1.2.2主要試劑

一步法TUNEL檢測試劑盒(綠色熒光)：江蘇凱基生物技術股份有限公司。大鼠IL-1β和IL-18 ELISA 檢測試劑盒：上海江萊生物科技有限公司。重組GSDMD 抗 體(ab219800)、NLRP3 抗 體(ab214185)、pro Caspase1+p10+p12 抗體(ab179515)、HRP 標記羊抗兔IgG 抗體(ab6721)：美國ABCAM 公司。GAPDH 抗體(10494-1-AP)：武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2.3主要儀器

醫用動脈瘤夾：德國貝朗。施夾鉗：德國雷伯公司。精密電子天平：瑞士PRESRCA。冰凍切片機：美國ThermoFisher 儀器有限公司。酶標儀：日本SANYO 公司。高速冷凍離心機：美國THERMO 公司。熒光顯微鏡：德國ZEISS。DYY-6C 電泳儀、UVTransilluminator 化學發光凝膠成像儀：美國BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1藥物制備

藥物提取方法參考孫勇[9]的文獻。稱取蜘蛛香藥材初步研磨為粉，經70%乙醇作兩次浸提處理：粗粉8 倍量乙醇浸泡1 d，收集浸液；換6 倍量乙醇繼續浸泡粗粉殘渣12 h；收集全部浸液進行減壓濃縮處理得粗浸膏。純化過程利用大孔樹脂進行，所得洗脫液進一步減壓濃縮，40 ℃真空干燥處理得浸膏。高效液相色譜分析法測得蜘蛛香環烯醚萜類成分的純度為71.5%。

藥物溶液(1 mg/ml)配制：稱取上述提取物0.5 g，以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液作為溶質進行超聲震蕩溶解，使蜘蛛香藥物在其中均勻混懸，繼續加入CMC-Na 溶液定容到500 ml，得到青黃色混懸液。4 ℃密封避光保存。

1.3.2模型制備

采用標定閉合力為70 g 的醫用動脈瘤夾鉗夾大鼠T10脊髓制備急性脊髓損傷模型。

模型組和治療組麻醉后，剔除周圍體毛，在操作臺上將大鼠俯臥固定。先確定T10棘突位置，再沿背部中線做縱向切口約3 cm，逐層分離皮膚及皮下肌肉組織，暴露T9～T11脊椎，去除椎板，將T10脊髓背側硬脊膜完全暴露出來。手持施夾鉗裝固好動脈瘤夾，從垂直于大鼠脊髓的方位由T10脊髓側邊置入，使完全橫跨T10脊髓，松開施夾鉗，鉗夾10 s 后撤出動脈瘤夾。手術部位經常溫生理鹽水沖洗后用棉球吸除溶液，縫合消毒。

假手術組除脊髓不做鉗夾損傷，其他操作同前。

造模成功的標志為鉗夾脊髓時出現大鼠雙后肢抽搐，尾部痙攣性擺動，且術后觀察大鼠后肢為完全癱瘓狀態，伴有膀胱功能障礙。

1.3.3術后護理及干預

術后密切關注大鼠生命體征，大鼠自主排尿功能喪失，需每天人工輔助導尿3 次，至膀胱功能恢復。前3 天每天腹腔注射青霉素20 萬U。整個飼養期間注意勤換墊料，清洗擦拭大鼠腹部及后肢，保持干燥。

術后4 h 待大鼠蘇醒，生命體征穩定，進行灌胃給藥，每天1次，連續7 d。治療組灌胃配置好的蜘蛛香環烯醚萜類溶液10 mg/kg[12]。模型組和假手術組灌胃同等劑量CMC-Na溶液。

1.3.4觀察指標及檢測

1.3.4.1HE染色

每組選取4 只大鼠采集脊髓組織制備病理切片。選用經心灌注固定取組織的方法[17]，10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術臺上，打開胸腔使心臟完全暴露，由左心室剪開一小口插入灌注針，先以生理鹽水約150 ml快速灌流15 min左右，再換用4%多聚甲醛固定液繼續灌注固定，調整流速先快后慢直至大鼠軀干四肢及尾部僵硬時停止。取材時以T10損傷處為中心，截取其前后0.5 cm 范圍脊髓組織，總長約1 cm，放置于固定液中，4 ℃過夜。待組織梯度脫水完畢后，OCT包埋，冰凍切片機切片，厚15 μm，后行HE 染色。于臺式顯微鏡下觀察組織全貌，再換病理顯微鏡20、40倍物鏡下觀察損傷區病理情況。使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統計算每張切片上脊髓組織損傷空洞部分單位面積占比。

殘存面積所占百分比=(1-損傷部位空洞面積占比)×100%

1.3.4.2TUNEL熒光染色

選取制備好的切片，TUNEL 染色實驗步驟根據試劑盒產品說明書進行。切片經固定通透等預處理后，按照說明書配制反應混合液，依步驟進行滴加。染色封片后在熒光顯微鏡下進行鏡檢，在高倍鏡下，每張切片選取6 個視野用于測定TUNEL 陽性(綠色)和細胞核(DAPI，藍色)數。

1.3.4.3ELISA

每組取4 只大鼠用于取血，麻醉后，促凝管心尖取血3 ml左右，離心取上清進行檢測。具體實驗步驟按照ELISA 試劑盒產品說明書進行。血清及試劑恢復至室溫后，在包被IL-1β、IL-18 抗體的96 孔板中分別加入相應反應試劑及樣品，反應完畢后立即使用酶標儀測量其吸光度，于450 nm 波長下讀取記錄相應數值，制作標準曲線，計算濃度。

1.3.4.4Western blotting

選取4只取新鮮脊髓。麻醉后，快速截取以T10脊髓損傷處為中心的1 cm長組織，根據蛋白提取試劑盒說明加入裂解液及相應蛋白酶抑制劑，剪碎后用勻漿器進行勻漿，渦旋10 s靜置5 min，重復3次，全過程在冰上進行，之后離心取上清。BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白上樣緩沖液按稀釋比例加入蛋白上清中，混勻后煮沸10 min，按20 μg上樣進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，以初始電壓80 V 進行電泳，大約30 min 后蛋白遷移到分離膠時轉120 V 電壓繼續電泳，直至分離出目標蛋白或蛋白電泳至凝膠底部。之后根據目標蛋白大小，使用PVDF 膜以恒流300 mA 進行轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(NLRP3 1∶1000；Caspase-1 1∶1000；GSDMD 1∶1000)，室溫下搖床孵育1 h 后，轉入4 ℃靜置過夜。隔天取出，搖床復溫1 h，TBST 洗去多余一抗，10 min 3 次，之后加入二抗(1∶1000)，繼續在搖床上孵育1 h，洗去多余二抗后ECL顯影。在凝膠成像系統中測定目標條帶的光密度值，目的蛋白相對表達含量為其積分光密度值比內參(GAPDH)積分光密度值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 進行統計學分析。計量資料采用Shapiro-Wilk 檢驗進行正態分布檢驗，服從正態分布以()表示，采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗進行兩兩組間比較。不服從正態分布或方差不齊則采用秩和檢驗，并對結果進行校正。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 HE染色

假手術組脊髓組織未見病變，其結構完好，內部無壞死空洞產生，灰白質結構正常，神經元結構完整，形態及分布正常，無顯著的炎性細胞浸潤出現。模型組脊髓組織發生一定程度的組織結構病變，出現大量神經元壞死及組織空洞，部分灰白質結構模糊，神經元構造分布紊亂，伴有大量炎性細胞浸潤，與假手術組相比，殘余組織面積減少(P＜0.05)。與模型組比較，治療組脊髓組織的壞死程度及空洞范圍相對較小，伴有少量炎性細胞浸潤，脊髓組織殘余面積增加(P＜0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組術后7 d脊髓組織HE染色

表1 各組脊髓組織殘余面積比較(%)

2.2 TUNEL熒光染色

假手術組綠色熒光強度極弱。與假手術組比較，模型組TUNEL 染色陽性率增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療組TUNEL 染色陽性率減少(P＜0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組術后7 d脊髓組織TUNEL染色(×400)

表2 各組脊髓組織TUNEL染色細胞陽性率比較(%)

2.3 ELISA

與假手術組比較，模型組IL-1β 和IL-18 含量增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療組IL-1β和IL-18含量減少(P＜0.05)。見表3。

表3 各組血清中IL-1β、IL-18含量比較(μg/ml)

2.4 Western blotting

與假手術組比較，模型組NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白水平增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療組NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白水平降低(P＜0.05)。見圖3、表4。

表4 各組焦亡蛋白的相對含量(/GAPDH)

圖3 各組術后7 d脊髓組織三種焦亡蛋白的表達(Western blotting)

3 討論

脊髓損傷的病理過程通常可分為原發性損傷和繼發性損傷兩個階段[18]。原發性損傷是創傷暴力實施的瞬間直接對組織產生的破壞，導致血管破裂、軸突斷裂和神經細胞死亡等，是一不可逆過程[19]。繼發性損傷以原發性損傷為基礎，是在其后即刻誘導發生的一系列細胞和分子的生物學級聯反應，可在受創最初的數分鐘內發生，根據病理進程分為急性期(數分鐘～14 d)、中期(14 d～6 個月)和慢性期(＞6 個月)[20]。在急性期內，受損細胞釋放胞內離子、活性蛋白及細胞因子等引發氧化應激、興奮性中毒、炎癥級聯反應等，加速受損部位神經細胞死亡[21]。細胞死亡的形式有多種，常見有自噬、凋亡、壞死和焦亡等，但哪個起主導作用尚未明確[22]。目前研究表明焦亡在細胞死亡中可能有較重要的作用[21,23]。在脊髓損傷中主要表現在繼發性損傷階段，此過程中產生觸發機體免疫反應的損傷有關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)，可由胞膜上特異性識別這些模式的受體(pattern recognition receptors,PRRs)所識別，如NLRP3 炎性小體的C 端結構域具有重復的賴氨酸序列即為DAMP的識別位點，一經結合活化，可觸發下游以Caspase-1為主導的細胞焦亡產生。

細胞焦亡為近年來提出的一種新型細胞程序性死亡的方式，直觀表現為DNA 片段化，核固縮，細胞器變形解體，胞膜穿孔，細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致胞內的內容物釋放進而引起強烈的炎癥級聯反應。該概念于2001 年由Cookson 等[24]首次定義提出。細胞焦亡的發生發展需要依賴Caspase 的參與，主要分為兩個途徑：依賴Caspase-1 的經典細胞焦亡途徑和Caspase-4/5/11介導的非經典途徑[25]。在經典途徑中，各種內源或外源性因素刺激細胞產生DAMP或病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)，導致胞漿中的PRRs，如核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NOD-like receptors,NLRs)被激活。其中NLRP3 作為典型的NOD 樣受體，激活后可通過其特定結構域與募集的細胞凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC) 和Caspase-1 前體分子結合，組裝為炎性小體，進一步使得Caspase-1前體活化[26-27]。在胞內活化的Caspase-1分子一方面能夠裂解IL-1β 和IL-18 前體使其加工成熟為具有活性的分子，另一方面能將GSDMD 切割為N 末端和C 末端兩個結構域(N/C-terminal domain of GSDMD,GSDMD-NT/GSDMD-CT)。有活性的GSDMD-NT 通過與磷脂分子結合從而錨定在細胞膜上，在膜上形成10～15 nm 的小孔，具有活性的炎癥因子如IL-18、IL-1β等通過膜孔釋放，水分子通過膜孔進入，細胞腫脹破裂，最終發生焦亡[28-29]。在焦亡過程中釋放的細胞促炎因子IL-1β、IL-18，能誘導炎性細胞的浸潤以及激活NF-κB 炎癥通路，會加重繼發性炎癥反應，引發大量神經細胞死亡[14]，對脊髓組織的病理結構產生嚴重損害。

細胞焦亡與癌癥[30]、自身免疫性疾病[31]、神經系統疾病[32-33]等的發生發展密切相關。NLRP3 作為細胞焦亡的重要分子，在脊髓損傷后可被活性氧、組織蛋白酶等神經毒性分子激活[34-35]。在有關大鼠脊髓損傷的研究中發現[36]，小膠質細胞可表達大量NLRP3炎性小體。Dai 等[37]發現雷公藤紅素可作用于NLRP3/Caspase-1 通路抑制神經細胞焦亡，利于脊髓損傷大鼠的后肢運動功能改善和恢復，并減少脊髓組織的空洞面積和神經細胞丟失。這些研究說明NLRP3 相關通路在脊髓損傷后的細胞焦亡中發揮關鍵作用。前期有關大鼠脊髓損傷研究中，蜘蛛香環烯醚萜類灌胃治療3 d可激活Nrf2/ARE通路減輕脊髓損傷氧化應激反應，一定程度上降低體內活性氧含量[38]，提示蜘蛛香環烯醚萜類藥物可能通過減輕脊髓損傷后活性氧的過量累積對炎性小體NLRP3 的激活作用，在一定程度上抑制細胞焦亡。

目前，蜘蛛香環烯醚萜類成分已被證實在脊髓損傷中能發揮神經保護作用[12-13]，涉及相關機制的研究較少，僅發現可能與調控Nrf2/ARE 通路減輕氧化應激有關[38]，更多機制仍待進一步探討。本研究從細胞焦亡的角度出發，證實蜘蛛香環烯醚萜類成分可抑制脊髓損傷后細胞焦亡，減輕炎癥，發揮神經保護作用，且與NLRP3/Caspase-1 這一經典細胞焦亡通路的調控相關，但具體的調控方式、抑制神經細胞焦亡的類型以及該藥物影響焦亡的途徑是否主要依賴此通路還需進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。