QuEChERS-HPLC-MS/MS法檢測谷物源性運動食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素

閆志光，田部男

（1.內蒙古體育職業學院 青少年訓練系，內蒙古 呼和浩特 010000；2.內蒙古集寧一中，內蒙古 烏蘭察布 012000）

雜色曲霉毒素（sterigmatocystin，SMC）、黃曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）兩者結構相似，都具有較強的致癌性，普遍存在于大米、小麥、玉米等谷物中[1-3]，常協同污染谷物及其制品。攝入被雜色曲霉毒素或者黃曲霉毒素污染的谷物易致癌、致畸，還極易在體內蓄積殘留，嚴重威脅人類健康[4-5]。谷物源性運動食品是指以谷物類原料制成的針對運動人群開發的一類補充營養素的食品。因其是針對特殊人群研發的一種食品，對安全性要求高，所以需要對這類產品中相關毒素殘留情況進行監控。

目前對食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的測定方法主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS）等[6-11]。TLC法具有操作簡便、成本低廉等優點，但重復性差，往往作為定性篩查方法；HPLC法具有靈敏度高、重現性好、普及性廣等優點，但對復雜基質樣品存在雜峰干擾等問題；HPLCMS/MS法具有分辨率高的優點，采用同位素內標法可準確定量，可作為定性定量檢測食品中雜色曲霉毒素的確證方法。本研究運用QuEChERS前處理凈化技術，避免一般前處理耗材成本較高的問題[12-13]，并依據質譜檢測器具有特異選擇性以及高靈敏度的特性[14]，提高了方法的檢出限和定量限，可為谷物源性運動食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的監控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜色曲霉毒素標準溶液（100.0 μg/mL），黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）B1、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）混合標準溶液（200.0 μg/mL）：上海安譜實驗科學科技有限公司；C18吸附劑：美國Agilent科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純）：美國Merck公司；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；植物蛋白營養粉（大豆蛋白）、小麥低聚肽運動營養粉、花生低聚肽運動營養粉、玉米肽運動營養強化粉：市售。

1.2 儀器與設備

LC-30A高效液相色譜儀：日本島津公司；AB SCIEX Triple TOF 5600高分辨質譜儀：美國AB SCIEX公司；TD-5高速離心機：上海盧湘儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取谷物源性運動食品5.0 g，加入20 mL提取液，超聲提取10 min。將鹽析劑[15-16]（無水硫酸鎂/氯化鈉/檸檬酸鈉二水合物/檸檬酸氫二鈉鹽倍半水合物=4∶1∶1∶0.5（g∶g））加入樣品中混勻后4 000 r/min離心2 min。吸取1.0 mL上清液并加入凈化劑，渦旋1 min后4 000 r/min離心2 min，取上清液過濾后進行分析。比較不同的提取液（乙腈-水（85∶15，V/V）、乙腈-水（70∶30，V/V）、甲醇-水（85∶15，V/V）、乙腈-水-甲酸（85∶14∶1，V/V））、凈化劑組合（30 mgSiO2+30mgC18、30 mg NH2+30 mgC18、30 mg弗羅里硅土+30 mg C18）對5種真菌毒素檢測效果的影響[17-21]。

1.3.2 標準溶液的配制

取適量的雜色曲霉毒素標準溶液和黃曲霉毒素混合標準溶液，以甲醇為溶劑配制成質量濃度0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL的系列標準溶液，置于棕色瓶中避光保存。

1.3.3 液相色譜條件

選用Atalantis T3耐高壓色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；樣品進樣量為2.0 μL；流動相A為0.15%甲酸溶液，流動相B為乙腈，流速為0.2 mL/min；梯度洗脫條件為0～0.5 min 90%A，2.0～5.0 min 10%A，5.1～10.0 min 90%A。

1.3.4 質譜條件[22-25]

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）：正離子電離（ESI+）；監測模式：多反應監測（multiple-reaction monitoring，MRM）；離子源溫度：105 ℃；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流量：10 L/min；錐孔流量：0.5 L/min；去溶劑溫度：400 ℃；其他質譜參數見表1。

表1 5種真菌毒素的多反應監測掃描模式的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of multi reaction monitoring scanning mode for 5 mycotoxins

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

為了使雜色曲霉毒素、4種黃曲霉毒素能夠有效分離，比較了在不同組分流動相（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液）條件下5種目標物的響應值和峰形，結果見圖1。由圖1可知，流動相體系中含有乙腈會改善起到增強目標物響應值的作用，在水相中加入0.1%甲酸溶液時雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的響應值較高，與其他3種流動相相比具有顯著性差異（P＜0.05），因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

圖1 不同流動相對5種真菌毒素響應值的影響Fig.1 Effect of different mobile phases on response value of 5 mycotoxins

2.1.2 流動相中甲酸溶液的優化

由于雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素屬于極性化合物[16]，流動相的組成會影響目標物的分離和離子化效率，從而影響到檢測的靈敏度。為了促進目標化合物的離子化，選擇乙腈和甲酸溶液作為流動相的組成，其中甲酸含量分別為0.05%、0.10%、0.15%和0.20%。結果表明，當甲酸溶液為0.15%時，雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的離子化效果最好，離子豐度最強，因此選擇0.15%甲酸溶液與乙腈組成流動相進行梯度洗脫。

在乙腈-0.15%甲酸溶液得到5種真菌毒素的總離子流圖見圖2。由圖2可知，雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的離子化效果最好，離子豐度最強。

圖2 乙腈-0.15%甲酸溶液流動相條件下5種真菌毒素標準品總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of 5 mycotoxins standard using acetonitrile-0.15% formic acid solution as mobile phase

2.2 QuEChERS前處理方法的優化

2.2.1 提取液的選擇

真菌毒素化合物易溶于甲醇、乙腈、水等極性溶劑中，常用提取液有乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-甲酸等類型[17-19]。本試驗具體比較了4種提取溶劑：乙腈-水（85∶15，V/V）、乙腈-水（70∶30，V/V）、甲醇-水（85∶15，V/V）、乙腈-水-甲酸（85∶14∶1，V/V）。試驗以大豆基質的谷物源性運動食品為對象，并添加5種真菌毒素制得陽性質控樣品（加標量均為1 μg/kg，混合均勻后放置一周檢測）。比較不同類型提取液對樣品中雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素提取效果的影響，結果以5種真菌毒素的測定值為比較依據，結果見圖3。

圖3 不同提取液對5種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solution on recovery rate of 5 mycotoxins

由圖3可知，不同提取液對雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的回收率存在顯著差異（P＜0.05），當選擇乙腈-水（85∶15，V/V）作為提取液時，加標樣品中5種真菌毒素的檢出含量最高，能達到0.53～0.71 μg/kg。在此比例的提取液中，5種極性化合物的真菌霉素在提取液中的分配系數高，故目標物的測定值較理想。

2.2.2 凈化劑的優化

由圖4可知，3組凈化劑組合對加標樣品中雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素檢測含量的影響差異顯著（P＜0.05），30 mg SiO2+30 mg C18的組合對凈化谷物源性運動食品的效果較好，加標樣品中5種真菌毒素的檢測含量能達到0.86～0.97 μg/kg，所以本試驗選擇了30 mg SiO2+30 mg C18作為凈化劑組合效果較好。

圖4 不同凈化劑組合對5種真菌毒素回收率的影響Fig.4 Effect of different combinations of purifying agents on recovery rate of 5 mycotoxins

2.3 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.15%甲酸流動相體系中，按上述條件進行測定，繪制標準曲線。取5種真菌毒素最低濃度的標準品溶液，連續進樣6次，考察色譜保留時間及峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以信噪比（S/N）=10計算定量限（limit of quantitation，LOQ），以S/N=3計算檢出限（limit of detection，LOD）。實驗結果5種目標組分在0.1～10.0 ng/mL范圍內均具有良好的線性關系，詳細結果見表2。

表2 5種真菌毒素的保留時間、線性回歸方程、相關系數、檢出限與定量限Table 2 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 5 mycotoxins

2.4 方法的精密度與回收率

在加標回收實驗中，選用谷物源性運動食品常見的小麥粉基質、玉米基質、大豆基質、花生基質共4種基質（樣品5種真菌毒素均未檢出），分別對3種不同加標量（SMC：0.5 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg，AFB1、AFG1：0.2 μg/kg、2 μg/kg和4μg/kg，AFB2：0.1μg/kg、1μg/kg和2μg/kg，AFG2：0.4μg/kg、4 μg/kg和8 μg/kg）的加標樣品連續5次的測定進行評價，考察谷物源性運動食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的回收率及方法精密度相對標準偏差（RSD），測定結果見表3。

表3 谷物源性運動食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的回收率及方法精密度試驗Table 3 Recovery rate and method precision test of sterigmatocystin and aflatoxins in cereal-derived sports food

由表3可見，在4種不同的谷源性運動食品基質中，雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的平均回收率為85.8%～99.4%，方法精密度RSD為2.72%～5.23%，說明本實驗的檢測數據的準確度和精密度可行。

2.5 實際樣品分析

通過本試驗建立的HPLC-MS/MS方法對市售的20份谷源性運動食品中的雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素進行定量分析。20份樣品中均未檢出雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素，整體情況良好。

3 結論

本研究建立的QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測谷物源性運動食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的分析方法，可有效去除谷物源性運動食品中的干擾物對目標峰的影響，實現對樣品中5種真菌毒素類的定性和定量分析。樣品經乙腈-水（85∶15，V/V）提取后，再由30 mg SiO2+30 mg C18凈化劑組合處理，在4種不同的源性基質中加標回收率能達到85.8%～99.4%，并具有可靠的準確度和精密度。適用于谷物源性運動食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的分析和定量檢測。