響應(yīng)面法優(yōu)化副干酪乳桿菌發(fā)酵沙棘酸奶工藝

胡盼盼

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn）屬于胡頹子科沙棘屬喬木或灌木[1]，擁有耐旱、抗風(fēng)沙的特點[2]，在我國沙棘資源占世界沙棘資源的90%以上[3]，因此我國有“沙棘王國”之稱[4]。沙棘果實含有大量的超氧化物和維生素[5-6]，富含有人體所需的各種氨基酸[7]，以及沙棘黃酮[8]、亞油素、脂肪酸等活性物質(zhì)，因此具有抗氧化[9]、抗菌、抗病毒以及抗糖尿病等生物活性[10]。酸奶是在純牛奶的基礎(chǔ)上經(jīng)過高溫滅菌，加入發(fā)酵劑、白砂糖等輔料發(fā)酵后制成的味道酸甜和口感細(xì)膩的乳制品[11]，乳酸菌在發(fā)酵中會產(chǎn)生多種代謝物質(zhì)，能調(diào)控腸道的菌群和滲透壓[12]，有利于腸道的通暢，可緩解便秘，營養(yǎng)價值優(yōu)于鮮奶和奶粉。近些年購買酸奶的人群數(shù)量不斷增多，市場龐大，廣受人們的喜歡。

目前沙棘的食用主要為鮮食、榨汁飲用等[13]，很少將沙棘用于酸奶的研制，因此優(yōu)化沙棘酸奶的加工工藝，可以使其營養(yǎng)價值和功效得到最大程度的利用。實驗室前期從新疆馬奶酒中自行篩選分離鑒定得到副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L，該菌株具有良好的發(fā)酵性能[14]及生物活性，并且已經(jīng)驗證其菌體[15]、胞外多糖[16]、發(fā)酵液等具有免疫和抗腫瘤等功能。

本研究旨在在傳統(tǒng)原味酸奶的制作基礎(chǔ)上加入沙棘汁，以感官評分為響應(yīng)值，通過單因素試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化副干酪乳桿菌M5L發(fā)酵制備沙棘酸奶的工藝，這不僅可以提高酸奶的營養(yǎng)價值，并且能豐富酸奶的口味，為開發(fā)功能性沙棘酸奶及相關(guān)乳飲料提供理論依據(jù)和工藝參數(shù)，對我國沙棘的深加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L：分離自新疆馬奶酒中，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院保藏；新鮮沙棘：于每年九月份采摘自呂梁汾陽市城子沙棘種植基地；新鮮全脂牛奶：離石區(qū)趙家莊奶牛場；白砂糖（食品級）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

NLG380型電磁爐：舟山南菱電子科技公司；BSA224S型電子稱：廣東省精密儀器公司；BCD-98A128型冷藏柜：上海新飛歐品公司；ZHWY-200D型酸奶發(fā)酵箱：廣州省恩時科技公司；BILONJJ-2型榨汁機：山東曲阜市魯強機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘酸奶制備工藝流程與操作要點

操作要點：選取新鮮沙棘為原料，摘下沙棘果洗凈并除去雜質(zhì)，然后進行壓榨，之后用過濾布除去沙棘渣，得到澄清的沙棘汁并用保鮮膜密封備用。將沙棘汁、純牛奶、白砂糖按比例調(diào)配，加熱攪拌至沸騰并持續(xù)20 min，在超凈工作臺上降溫。然后按比例添加發(fā)酵劑，攪勻密封，放置到42 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，發(fā)酵完成后及時取出，降至常溫之后在4 ℃冷藏柜中放置12 h后進行感官評定和酸度值測定。

1.3.2 副干酪乳桿菌發(fā)酵制備沙棘酸奶的工藝優(yōu)化

單因素試驗：在白砂糖添加量為8%、發(fā)酵劑用量為1%的工藝條件下，以酸度和感官評分為評價指標(biāo)，考察沙棘汁添加量（6%、9%、12%、15%、18%）對沙棘酸奶品質(zhì)的影響。在此基礎(chǔ)上，依次考察白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）和發(fā)酵劑添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）對沙棘酸奶品質(zhì)的影響。

響應(yīng)面試驗：根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計，基于單因素試驗結(jié)果，選取沙棘汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）及發(fā)酵劑添加量（C）為考察因素，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 10.0進行優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 沙棘酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for sea-buckthorn yogurt fermentation process optimization

1.3.3 分析測定方法

感官評定：根據(jù)中國乳制品工業(yè)行業(yè)規(guī)定RHB103《酸牛乳感官質(zhì)量評鑒細(xì)則》[17]，選取顏色、口味、風(fēng)味、組織形態(tài)作為產(chǎn)品評分的標(biāo)準(zhǔn)。挑選10名專業(yè)人員分別對成品酸奶進行打分（總分為100分），計算出10名人員得分的平均值即為該發(fā)酵酸奶的感官評分，其評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 酸奶的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of yoghurt

微生物指標(biāo)：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)對酸奶的大腸桿菌[17]、乳酸菌數(shù)[18]以及致病菌[19-20]等進行測定。

理化指標(biāo)：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)對酸奶的酸度[21]、蛋白含量[22]、脂肪含量[23]等進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 沙棘汁添加量對酸奶品質(zhì)的影響

沙棘汁添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖1。由圖1可知，沙棘汁添加量對酸奶的酸度影響較小，而隨著沙棘汁添加量的增加，酸奶的感官評分呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當(dāng)沙棘汁添加量為6%時，產(chǎn)品口味較淡，色澤較淺，因此感官評分較低為75分；當(dāng)沙棘汁添加量為12%時，產(chǎn)品口感、顏色及風(fēng)味最佳，感官評分最高，為90分；繼續(xù)增加沙棘汁添加量則會因為沙棘味較重而掩蓋酸奶原有風(fēng)味，導(dǎo)致感官評分降低。因此，確定最佳沙棘汁添加量為12%。

圖1 沙棘汁添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of sea-buckthorn juice addition on the quality of yoghurt

2.1.2 白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響

白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖2。由圖2可知，白砂糖添加量對酸奶的酸度影響較小，而酸奶的感官評分隨著白砂糖添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)白砂糖添加量為8%時，感官評分最高，為90分。當(dāng)白砂糖添加量較小時，酸奶酸味太重，口感較差。當(dāng)白砂糖添加量＞8%之后，又因甜味過重，酸奶特有香味減小，感官評分隨之降低。因此，確定最佳糖添加量為8%。

圖2 白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of sugar addition on the quality of yoghurt

2.1.3 發(fā)酵劑添加量對酸奶品質(zhì)的影響

發(fā)酵劑添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵劑添加量的增大，由于乳酸菌數(shù)量不斷增加使得酸奶酸度不斷增加，當(dāng)添加量＞1.0%之后，酸奶酸度不再變化，這可能由于乳酸菌數(shù)量過多，而營養(yǎng)物質(zhì)有限，活菌量達(dá)到最大，產(chǎn)酸量穩(wěn)定。副干酪乳桿菌發(fā)酵沙棘酸奶的感官評分隨發(fā)酵劑添加量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵劑添加量為0.8%時，酸奶的感官評分最高，為91分。發(fā)酵劑添加量較低，酸奶成型較差，風(fēng)味較淡，但添加量不斷增大后，營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，酸度較大而導(dǎo)致酸奶風(fēng)味苦澀，使得感官評分不斷降低。因此，確定最佳發(fā)酵劑添加量為0.8%。

圖3 副干酪乳桿菌添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus paracasei addition on the quality of yoghurt

2.2 沙棘酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及分析

副干酪乳桿菌發(fā)酵沙棘酸奶制作工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 沙棘酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for sea-buckthorn yogurt fermentation process optimization

以感官評分為主要考察指標(biāo)，應(yīng)用Design Expert 10.0軟件對表3試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到以副干酪乳桿菌發(fā)酵酸奶感官評分（Y）為響應(yīng)值，與影響因素沙棘汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵劑添加量（C）的二次回歸方程：Y=91.40-0.63A+0.12B-0.75C+0.25AB-1.00AC+0.50BC-6.83A2-3.32B2-1.58C2。對該模型進行方差分析及模型系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由表4可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項的P值＞0.05，不顯著，表示結(jié)果與實際符合。一次項C、交互項AC及二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項A對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.982 6，說明此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高，試驗誤差小，預(yù)測結(jié)果較好。3個因素對沙棘酸奶品質(zhì)影響的大小依次是C（發(fā)酵劑添加量）＞A（沙棘汁添加量）＞B（白砂糖添加量）。

2.2.2 各因素交互響應(yīng)面優(yōu)化分析

應(yīng)用Design Expert 10.0對試驗結(jié)果進行分析，繪制響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，沙棘汁和發(fā)酵劑添加量的交互作用等高線為橢圓形，響應(yīng)面不平緩，說明沙棘汁和發(fā)酵劑添加量對沙棘酸奶感官評分的影響顯著（P＜0.05），白砂糖和沙棘汁、白砂糖和發(fā)酵劑添加量間交互作用的等高線接近圓形，響應(yīng)面圖比較平緩，說明影響不顯著（P＞0.05），與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素間交互作用對沙棘酸奶感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score

2.3 最佳工藝條件的驗證

由響應(yīng)面優(yōu)化得到沙棘酸奶的最優(yōu)發(fā)酵工藝為沙棘汁添加量11.91%、白砂糖添加量8%、發(fā)酵劑添加量0.95%，預(yù)測的感官評分為91.49分。但是由于考慮到操作過程的可行性，將工藝條件調(diào)整為沙棘汁添加量12%、白砂糖添加量8%、發(fā)酵劑添加量1%。在此條件下進行驗證試驗，沙棘酸奶的感官評分實際值為91.33分，結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化出的副干酪乳桿菌沙棘酸奶工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

2.4 沙棘酸奶產(chǎn)品分析測定

2.4.1 感官評價

根據(jù)最優(yōu)工藝條件制備的凝固型沙棘酸奶色澤呈現(xiàn)乳白色略帶淡黃色，口感細(xì)膩、柔和，帶有沙棘的清香，酸甜可口，組織狀態(tài)均勻，無乳清晰出，無分層現(xiàn)象[24]。

2.4.2 微生物指標(biāo)

沙棘酸奶中未檢出大腸桿菌，乳酸菌活菌數(shù)為1.4×107CFU/mL，致病菌未檢出，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的規(guī)定（乳酸菌活菌數(shù)≥1.0×106CFU/mL，致病菌和大腸桿菌不準(zhǔn)檢出）[25]。

2.4.3 理化指標(biāo)

沙棘酸奶的酸度為83.0°T，蛋白質(zhì)含量為3.6%，脂肪含量為2.9%，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的規(guī)定（酸度≥70.0°T、蛋白質(zhì)含量≥2.3%、脂肪含量≥2.5%）[25]。

3 結(jié)論

本試驗以感官評分為響應(yīng)值，采用單因素及響應(yīng)面法對副干酪乳桿菌發(fā)酵沙棘酸奶的工藝進行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝為沙棘汁添加量12%，白砂糖添加量8%，發(fā)酵劑添加量1%。在此優(yōu)化條件下得到的沙棘酸奶呈淡黃色，具有沙棘和酸奶清香味，酸甜適中，組織細(xì)膩，穩(wěn)定性好、無乳清晰出，感官評分最高，為91.33分。并且產(chǎn)品理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010《發(fā)酵乳》的相關(guān)要求。副干酪乳桿菌發(fā)酵沙棘酸奶不僅具有沙棘和乳酸菌的特有的營養(yǎng)和風(fēng)味，同時也為研發(fā)有價值的乳制品生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，對沙棘深加工的研究具有重要的意義。