耐高滲酵母選育及其在葡萄酒中的應用研究

金 紅，張小燕，路宏科，殷 欣，張 輝，彭 濤

（甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州 730000）

優良的葡萄釀酒酵母應具備起酵快，耐高酒精度、高SO2、高糖、高溫、低溫等特性，同時還應能促使發酵進行徹底，實現酒體協調、易于長期儲存等。

葡萄酒釀造過程中，隨著發酵底物中酒精、糖、硫的濃度變化，酵母菌的耐受力會影響其生長及發酵活性。酒精濃度不斷增加，酵母的繁殖速度及存活率會急速下降[1]，殘糖、酸將會影響酒的品質。已有研究者對外加酒精的培養基進行過酒精耐性對比試驗[2-3]。研究表明，酵母細胞內細胞質組成及水分活度會隨著高滲透脅迫而發生明顯變化，高鹽、高糖、高硫等發酵環境，常常會影響酵母菌的生長繁育[4]。因此，在葡萄濃醪發酵過程中，耐高滲酵母可以很好地應用于釀酒工業。

本實驗對收集的廢酒糟酵母資源[5-6]進行系統實驗研究，篩選出耐高滲的釀酒酵母，應用于葡萄酒釀造，并優化發酵工藝，旨在為高酒精度、無防腐劑的葡萄酒釀造選育優良菌株提供理論依據，開辟葡萄酒研發新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鮮葡萄酒渣、鮮黃酒糟、鮮酒醅：某葡萄酒、黃酒、白酒生產企業提供；商業酵母BV818：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、酵母浸粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鉀、硫酸銨、亞硫酸鈉、酒精、氯化鈉（均為分析純或生化試劑）：甘肅省石化物資貿易公司化玻儀器設備分公司。

1.1.3 培養基

富集篩選培養基（1#培養基）：葡萄糖5%，酵母膏0.05%，KH2PO40.25%，FeSO4·7H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.1%，（NH4）2SO40.2%，滅菌后加Na2SO3至30 mg/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基[7]（2#培養基）：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、牛肉膏10 g、蒸餾水1 000 mL，60 μg/mL鏈霉素；添加20 g/L瓊脂為固體培養基。

WL營養培養基（3#培養基）：酵母浸粉0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、瓊脂2%；儲液A：KH2PO45.5 g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，使用時按40 mL/1 000 mL添加[8]；儲液B：FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，使用時按1 mL/1 000 mL添加，調pH值至6.5，滅菌后加儲液C。儲液C：0.44 g溴甲酚綠溶于100 mL體積分數50%的酒精溶液中，使用時按1 mL/1 000 mL添加。

發酵培養基[9]（4#培養基）：蔗糖20%，KH2PO40.1%，（NH4）2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，酵母膏1%。

酵母氮基礎培養基及酵母碳基礎培養基[10]（5#培養基）：葡萄糖20.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母膏0.2 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

尿素基礎培養基（6#培養基）：蛋白胨1.0 g，NaCl 5.0 g，KH2PO42.0g，酚紅0.012g，瓊脂20.0g，pH6.8，蒸餾水1000mL。

蛋白胨水培養基（7#培養基）：蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.6。

上述培養基均115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司；AL204電子天平：德國METTLER TOLEDO公司；LDZX-75-KBS立式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；BK-3300生物顯微鏡：上海宙山精密光學儀器有限公司；600電熱恒溫水浴槽：北京科偉永興儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機：EYELA東京理化器械株式會社；SHP-250生化培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；RE-3000 RE-10000旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分離純化

（1）樣品采集：將從相關企業分別采集的鮮酒醅、酒渣、酒糟，真空密封儲存于冰盒中，24 h內送至實驗室，備用。

（2）菌株富集培養及分離純化：將采集到的酒醅、酒渣、鮮酒糟樣品分別稱取10 g，分別加入90 mL滅菌的1#培養基，28 ℃、160 r/min搖床培養48 h。將培養液用生理鹽水進行不同梯度稀釋后，涂布于2#培養基上分離，28 ℃培養48 h，轉接并經多次劃線純化，獲得純化菌株，接種于試管斜面，依次放入冰箱中，4 ℃保存備用。

（3）將純化菌株活化后，劃線接種于WL培養基上，28 ℃培養5～7d，觀察記錄菌落的顏色及形態特征，進行分類鑒定。

1.3.2 菌株發酵特性

采用杜氏管法對分離得到的酵母菌進行發酵力測定，挑選發酵速度快、起發時間早及發酵氣味好的菌株。

酒精度耐受性測定：用杜氏管發酵法。將篩選出的酵母菌分別接入酒精度分別為12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol的2#液體培養基中，28 ℃靜置培養，每12 h觀察一次，記錄氣體充滿杜氏管的時間。

糖度耐受性測定：用杜氏管發酵法。將篩選出的酵母菌分別接入葡萄糖含量分別為20%、30%、40%、50%、60%的2#液體培養基中，28 ℃靜置培養，每12 h觀察一次，記錄氣體充滿杜氏管的時間。

SO2濃度耐受性測定：用杜氏管發酵法。將篩選出的酵母菌分別接入SO2含量為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L的2#液體培養基中，28 ℃靜置培養，每12 h觀察一次，記錄氣體充滿杜氏管的時間。

1.3.3 菌株模擬酒精發酵試驗

將篩選菌株轉接入4#培養基，28 ℃靜置發酵，至發酵液重量不再下降時為發酵終點。以商品酵母BV818作對照。

1.3.4 生理生化試驗

碳源同化試驗：將含有杜氏小管的試管滅菌后加入5#培養基3～4 mL，然后向其中半數的試管分別加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖作為碳源，調整糖濃度達到50mmol/L，滅菌[11]。將所有試管都接入供試菌，以沒有加碳源的試管作為對照，28 ℃培養7 d，觀察。如果試管出現渾濁為陽性，否則為陰性。

氮源同化試驗：將含有杜氏小管的試管滅菌后加入5#培養基3～4 mL，然后向其中半數的試管分別加入硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉作為氮源，調整氮源濃度達到50 mmol/L，滅菌。將所有試管都接入供試菌，以沒有加氮源的試管作為對照。28 ℃恒溫培養7 d，觀察。以試管中出現渾濁為陽性，否則為為陰性。

水解尿素試驗：試管中加入2.7 mL的6#基礎培養基，滅菌后，再向每支試管中加0.3 mL無菌水配制的20%已滅菌的尿素溶液，混合后擺斜面。挑取活化的菌株，接種于制好的斜面上，28 ℃培養，每天觀察結果，5～7 d后，若斜面呈現淡紅色，則說明此菌株能分解尿素。試驗重復3次[12]。

1.3.5 葡萄酒發酵試驗[13-18]

預試驗的結果顯示，高泡期流加濃縮汁底物濃度外觀糖偏低，以致最終發酵酒精度有所降低，因此調整葡萄酒發酵試驗方案為：初始底物濃度外觀糖為28%，提高高泡期補料后底物外觀糖至34%；接種量為106CFU/mL；菌株接種方式兩種：（1）釀酒酵母和膜醭畢赤氏酵母以70%∶30%、50%∶50%、30%∶70%體積比同時接入濃縮葡萄汁中；（2）發酵初期接種釀酒酵母，高泡期補料后接種膜醭畢赤氏酵母。20 ℃發酵15 d。

1.3.6 測定方法[19-23]

發酵力：采用CO2失質量法；酒精度：采用密度瓶法；還原糖：采用直接滴定法；酸度：采用滴定法；香味：采用感官評定方法。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離純化

由表1可知，從鮮葡萄酒糟、鮮黃酒糟、鮮酒醅共分離純化出8株酵母菌，分別編號為A～H。

表1 酵母菌的形態特征Table 1 Morphological characteristics of yeast

2.2 菌株發酵特性及耐受性結果分析

2.2.1 菌株發酵特性

采用杜氏管法對分離得到的8株酵母菌進行發酵力測定，結果見表2。

表2 優選菌株發酵特性試驗結果Table 2 Experimental results of fermentation characteristics of the preferred yeast strains

由表2可知，菌株A、B、C發酵速度最快；菌株A起發時間最短，為2 h，發酵具有濃郁的酒香味。

2.2.2 優選酵母菌株的酒精、葡萄糖及SO2耐受性

由表3可知，酵母菌的生長繁殖隨著酒精含量的增高而受到抑制，酒精含量越高，酵母菌的生長繁殖越弱。菌株A、B對酒精的耐受度比較好，其中菌株B耐受20%vol酒精21.3 h，仍可以啟動發酵。

表3 酵母菌株酒精耐受性試驗結果Table 3 Alcohol tolerance test results of yeast

由表4可知，菌株A、B和D對于糖具有較好的耐受性，均可在耐受60%糖濃度的情況下21.5 h后可以啟動發酵。

表4 酵母菌株葡萄糖耐受性試驗結果Table 4 Glucose tolerance test results of yeast strains

由表5可知，菌株A、B、D表現出較強的SO2耐受性，均可在耐受300 mg/L SO2的情況下6.7 h后可以啟動發酵。綜合耐受性試驗結果，選擇菌株A、菌株B進行模擬酒精發酵試驗。

表5 酵母菌株SO2耐受性試驗結果Table 5 Sulfur dioxide tolerance test results of yeast strains

2.3 優良菌株發酵試驗結果分析

由表6可知，菌株A產酒精度為10.8%vol，高于商品酵母BV818所產酒精度（9.2%vol），且產酒香氣較好，可作為優良菌株保存；菌株B產酒精度9.2%vol與商業酵母BV818所產酒精度（9.2%vol）相當，也可作為優良菌株保存。

表6 酵母菌株模擬酒精發酵試驗結果Table 6 Results of simulated alcoholic fermentation of yeast strains

2.4 生理生化鑒定

對菌株A、菌株B進行生理生化鑒定，結果見表7。由生理生化試驗結果可以初步鑒定菌株A、菌株B分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。

表7 菌株生理生化鑒定結果Table 7 Physiological and biochemical identification results of the strain

2.5 葡萄酒發酵試驗結果分析

由表8可知，在濃縮葡萄汁初始糖含量28%條件下接種菌株A，高泡期補料至含糖量34%接種菌株B，20 ℃發酵15 d，得到的葡萄酒酒精度最高，為18.1%vol。

表8 濃縮葡萄汁補料分期接入酵母菌株發酵結果Table 8 Fermentation results of concentrated grape juice feeding by stages with yeast strains

3 結論

該實驗從葡萄酒糟、黃酒糟、酒醅，經過富集篩選分離純化得到8株酵母菌，經高酒精度、高糖度、高SO2耐受試驗后初步篩選出2株菌株，一株耐高糖，在含糖量60%條件下21.5 h仍可啟動發酵；一株耐高酒精度，在酒精度20%vol條件下21.3 h仍可啟動發酵；2株菌株均可在300 mg/L SO2條件下在6.7 h啟動發酵。經生理生化試驗初步鑒定兩株菌分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。在濃縮葡萄汁初始糖含量28%條件下接種釀酒酵母，高泡期補料至含糖量34%接種膜醭畢赤氏酵母，20℃發酵15d，得到的葡萄酒酒精度為18.1%vol。通過本試驗為西北地區特色葡萄酒釀造提供了前瞻性的發酵菌株和工藝參數，以期為國內特色葡萄酒產業做一些探索性的研究。