響應面法優化靈芝發酵三七渣產靈芝三萜工藝

譚顯東，陳 楠，王 浪，魏 琨，吉栗漫

（成都信息工程大學 資源環境學院，四川 成都 610225）

靈芝（Ganoderma lucidum）又名仙草、瑞草，屬靈芝屬，多孔菌科真菌，其中包括赤芝和紫芝的干燥子實體[1]。屬擔子菌門（Basidionmycota），擔子菌綱（Basidiomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），靈芝科（Ganodermataeea）類真菌。靈芝三萜類化合物是靈芝中除靈芝多糖外另一類重要的活性物質。它的基本構成是由30個碳原子組成，具有很高的脂溶性，其分子質量通常在400～600之間，具有比較復雜的化學結構，其結構由六個異戊二烯單位聚合而成。三萜類化合物大多數為四環和五環三萜，少數為鏈狀、單環、雙環和三環三萜[2]。靈芝三萜類化合物具有保肝護肝、抗腫瘤、增強免疫、抗氧化、降血脂血糖等功效[3-4]，在食品生產加工以及臨床醫學領域具有廣泛的應用前景。

三七（Panax notoginseng）藥渣中含有大量的粗蛋白、粗纖維、粗多糖、粗脂肪等有機物和磷、鈣、鎂等礦質元素以及一些微量元素鋅、錳等，適合作為發酵基質使用[5]。相關研究人員以三七渣為原料，變廢為寶，成功開發了多種高附加值的產品[6-7]。采用靈芝固態發酵三七渣生產靈芝三萜可以為三七渣的資源化利用開辟一條新的途徑，但三七渣的營養組成不能滿足靈芝生長及靈芝三萜合成的需求。本研究以三七渣為基質，固體發酵生產靈芝三萜，通過單因素試驗及Box-Behnken試驗對三七渣固體培養基的制備條件進行了優化，使其更適合靈芝生長及靈芝三萜的合成。選擇采用三七渣培養基產靈芝三萜，既能夠實現三七渣的資源化利用，提高其附加值，又能夠為靈芝三萜的生產提供一條新的低成本途徑，以期為工業規模利用三七渣固態發酵生產靈芝三萜提供培養基組成的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

川芝6號（國品認菌2007045，川審菌2004007）：由四川省農業科學院土壤肥料研究所微生物室提供；三七渣：取自成都市某中成藥廠，經日曬、烘干、粉碎、過篩后置于干燥器中備用，主要成分為真蛋白9.97%、粗蛋白12.28%、粗纖維27.45%、還原糖2.19%、總糖48.87%、淀粉30.35%[8]。

1.1.2 化學試劑

酵母浸出粉（生化試劑）、齊墩果酸（純度＞98%）、磷酸二氫鉀、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 培養基

種子液培養基：20 g土豆，2.0 g葡萄糖，0.3 g酵母粉，0.2 g蛋白胨，0.1 g KH2PO4，0.06 g MgSO4，1 000 mL蒸餾水。

121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：20g土豆，2.0g葡萄糖，0.3g酵母粉，0.2 g蛋白胨，0.1 gKH2PO4，0.06 g MgSO4，2.0 g瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水。121 ℃滅菌20 min。

三七渣固體培養基：采用過60目篩的三七渣10.00 g，酵母浸出粉3%，培養基初始含水量為60%，pH自然。121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SF-130中藥分析研磨機：長沙中南制藥機械廠；PYX-280H-C恒溫恒濕生化培養箱：廣東韶關科力試驗儀器有限公司；QYC—211水浴恒溫振蕩器：上海?，攲嶒炘O備有限公司；VT1300L-U超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司：LDZX-50KB高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；UV-2550紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將川芝6號接入PDA培養基中，于28 ℃條件下恒溫靜置培養7～8 d，用于菌種的活化擴大培養。

1.3.2 種子液制備及固態發酵

用打孔器在PDA培養基的邊緣打取0.25 cm2的靈芝菌絲塊，接入裝液量為100 mL/250 mL種子液培養基中，置于水浴恒溫振蕩器中，在150 r/min、28 ℃條件下振蕩培養4 d，得到靈芝菌種子液。將川芝6號孢子種子液10%接種至三七渣固態發酵培養基，培養溫度為28 ℃，培養時間為12 d。

1.3.3 發酵培養基組成優化

（1）單因素試驗

分別考察三七渣固態發酵培養基中酵母浸出粉添加量（0、1%、2%、3%、4%、5%、6%）、磷酸二氫鉀添加量（0、0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%）、初始水含量（30%、40%、50%、60%、70%、80%）對靈芝三萜產量的影響。

（2）Box-Behnken試驗[9]

在單因素試驗的基礎上，以靈芝三萜產量（Y）為響應值，酵母粉添加量（A）、磷酸鹽添加量（B）及培養基初始含水量（C）為自變量，采用響應面法優化發酵條件，并用-1、0、1對每個自變量的低、中、高3個水平進行編碼，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 靈芝三萜含量的測定[10-11]

準確稱取0.50 g發酵培養物，置于50 mL比色管中，加入12.5 mL體積分數為75%乙醇進行超聲處理（溫度40 ℃；功率250 W；時間45 min），超聲處理結束后，加體積分數為75%的乙醇溶液定容至50 mL，搖勻，再經過5 000 r/min離心10 min，取上清液保存備用。

吸取0.1 mL上清液置于比色管中（空白樣加0.1 mL無水乙醇），用沸水浴加熱煮干其中的溶劑，再依次加入5%的香草醛溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后放入水浴鍋中60 ℃保溫處理20 min。取出冷卻，加5 mL冰乙酸，搖勻，在波長550 nm處測定其吸光度值。

以齊墩果酸為對照品，采用上述方法制作齊墩果酸標準曲線，按照齊墩果酸標準曲線回歸方程計算發酵培養物中靈芝三萜的含量。

2 結果與分析

2.1 培養基優化單因素試驗

2.1.1 酵母浸出粉添加量對靈芝三萜產量的影響

氮源是影響微生物酶合成的重要因素之一[12]，相對于無機氮源而言，靈芝能夠更好地利用有機氮源[13]。C/N對微生物的生長影響較大，適宜的C/N能夠更好的促進菌體的生長及代謝產物的生成[14]。有研究表明酵母提取物是產生三萜類化合物的最佳氮源[15-16]，因此本次研究按0、1%、2%、3%、4%、5%、6%的比例在三七渣中添加酵母浸出粉，進行固態發酵，考察其對發酵培養物中靈芝三萜產量的影響，結果如圖1所示。

圖1 酵母浸出粉添加量對靈芝三萜產量的影響Fig.1 Effect of yeast extract powder addition on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

由圖1可以看出，酵母浸出粉添加量在0～3%范圍內的增大，靈芝三萜的產量隨之增加；當酵母浸出粉添加量為3%時，靈芝三萜產量達到最大值，為0.39%；當酵母浸出粉添加量＞3%之后，靈芝三萜產量有所下降。這是因為適當的氮源有助于菌體的生長、發育和次級代謝，但當氮源過多時會使轉錄因子Are A在促進氮源代謝的過程時還會激活硝酸還原酶產生抑制靈芝三萜合成的NO，導致靈芝三萜產量降低[17-18]，只有添加合適量的氮源才能夠促進靈芝菌體的生長及靈芝三萜的合成。因此，最佳酵母浸出粉添加量為3%。

2.1.2 初始含水量對靈芝三萜產量的影響

培養基的初始含水量是影響固態發酵過程中次級代謝產物生產的重要因素之一[19]。本次試驗中分別調節培養基的初始含水量為：30%、40%、50%、60%、70%、80%，考察培養基初始含水量對發酵培養物中靈芝三萜產量的影響，結果如圖2所示。

圖2 初始含水量對靈芝三萜產量的影響Fig.2 Effect of initial moisture contends on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

由圖2可以看出，當培養基初始含水量為30%～60%時，靈芝三萜的產量隨之增加；當培養基初始含水量為60%時，靈芝三萜產量達到最大值，為0.38%；當培養基初始含水量＞60%之后，靈芝三萜的產量隨之下降。這與采用中藥渣發酵[20]、竹粉發酵[21]培養靈芝的研究結果相似。含水量過低或者過高都不利于靈芝三萜的生產，這是因為一方面，適當的含水量才有利于該體系熱傳遞以及CO2、O2的交換；另一方面，三七渣基質顆粒間的自由水也能夠作為良好的載體起到一定的傳質作用。當基質中含水率過低時，基質中的自由水不足以維持靈芝的生長需求，進而破壞其新陳代謝平衡；當基質中含水率過高時，培養基容易黏結成團，從而影響物料的透氣性，不利于微生物生長繁殖及代謝產物的生成[22]。因此，最佳培養基初始含水量為60%。

2.1.3 磷酸鹽添加量對靈芝三萜產量的影響

磷元素是多種微生物細胞組成物質，如菌體核酸、蛋白、細胞膜等的重要成分[23]；鈣元素能夠中和菌體生長過程中產生的有機酸，還有助于菌體細胞膜的穩定性[24]；鉀元素能夠對細胞內酸堿度起到一定的調節作用，另外在酶促反應中還可作為輔助因子或激活劑。由此可見，無機鹽是影響微生物菌體生長和繁殖的重要因素[25]。

本研究選取磷酸二氫鉀作為磷源。在三七渣基質中按0、0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%的比例添加KH2PO4，考察其對發酵培養物中靈芝三萜產量的影響，結果如圖3所示。

圖3 磷酸二氫鉀添加量對靈芝三萜產量的影響Fig.3 Effect of potassium dihydrogen phosphate addition on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

由圖3可知，當磷酸二氫鉀添加量為0～0.125%時，靈芝三萜的產量隨著磷酸二氫鉀添加量的增加而增加；當磷酸二氫鉀添加量為0.125%時，靈芝三萜產量達到最大值，為0.36%；當磷酸二氫鉀添加量＞0.125%之后，靈芝三萜的產量隨之下降。當磷酸二氫鉀添加量繼續增大，靈芝三萜含量會逐漸減少。可能的原因在于，磷元素添加過量，會導致滲透壓的不平衡以及抑制參與中心代謝和次級代謝等的一系列基因的轉錄表達，從而對靈芝菌體的生長和代謝產物的合成起到抑制作用[26-27]。因此，最佳磷酸二氫鉀添加量為0.125%。

2.2 培養基優化響應面試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，以靈芝三萜產量（Y）為響應值，酵母粉添加量（A）、磷酸鹽添加量（B）及培養基初始含水量（C）為自變量，采用響應面法優化發酵條件，Box-Behnken試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert8.0.6軟件對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，得到靈芝三萜產量（Y）對酵母浸出粉的添加量（A）、磷酸鹽的添加量（B）及培養基初始含水量（C）的多元回歸方程：

由表3可知，該回歸模型極其顯著（P＜0.0001），而失擬項不顯著（P＞0.05），決定系數R2=0.997 9，校正決定系數R2Adj=0.995 2，說明該模型可以解釋大約99.52%的靈芝三萜含量響應值的變化。由此可見該二元回歸模型可以用來分析與預測該發酵體系中靈芝三萜含量的實際情況。一次項A、C、交互項AB、AC、BC及二次項A2、B2、C2均對靈芝三萜含量的影響極顯著（P＜0.01）；一次項B對靈芝三萜含量的影響不顯著（P＞0.05）。該三種因素對于靈芝三萜含量的影響程度排序為：培養基初始含水量（C）＞酵母浸出粉添加量（A）＞磷酸鹽添加量（B）。

2.2.2 影響因素的交互作用分析[28-29]

利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制回歸模型的三維響應面及等高線，考察不同因素之間的交互作用對靈芝三萜產量的影響，結果見圖4。

由圖4A可知，酵母浸出粉添加量與磷酸鹽添加量交互作用極顯著。當三七渣中酵母浸出粉和磷酸二氫鉀添加量較少時，靈芝三萜含量較低。隨著酵母浸出粉和磷酸二氫鉀添加量的增加，靈芝三萜含量開始增加，但當二者添加到一定量之后靈芝三萜含量會有輕微下降。

由圖4B可知，酵母浸出粉添加量和培養基初始含水量兩者之間的交互作用極顯著。當培養基初始含水量處于較低水平時，靈芝三萜的含量也較低。這是因為初始含水量低時，氮源等營養物質的溶解浸出及傳遞受阻，靈芝不能充分利用營養物質。

由圖4C可知，磷酸二氫鉀添加量和培養基初始含水量之間的交互作用極顯著。當培養基初始含水量處于較低水平時，隨著磷酸鹽添加量的增加，靈芝三萜的含量先增加后減少，但整體處于一個較低的水平，可見磷酸鹽添加量對靈芝三萜產量的影響不顯著，這與回歸模型方程顯著性分析結果相同。

圖4 酵母浸出粉添加量、磷酸鹽添加量和培養基初始含水量交互作用對靈芝三萜產量影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between the yeast extract addition,the phosphate addition and initial substrate moisture on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

響應值對影響因素的敏感程度，可以由三維響應圖中各影響因素曲面的陡峭程度來判斷[30]。由圖4可知，培養基含水量影響最為顯著，其曲面最為陡峭，靈芝三萜含量隨培養基含水量的變化而顯著變化；酵母粉添加量的曲面較為陡峭，對靈芝三萜含量影響相對顯著，但其曲面較于培養基含水量稍顯平緩；磷酸鹽添加量曲面坡度較于酵母粉添加量顯平緩。該結論與回歸模型分析結果一致，各因素對靈芝三萜含量的影響程度排序為：培養基初始含水量＞酵母粉添加量＞磷酸鹽添加量。

通過對該多元回歸模型方程求偏導與解逆矩陣，求得該模型的極值點：酵母浸出粉添加量為2.47%，磷酸二氫鉀添加量為0.145%，培養基初始含水量為65.47%，在此優化條件下，發酵培養物中靈芝三萜產量的預測值為0.380%?？紤]實際操作條件，將發酵條件調整為酵母浸出粉添加量為2.5%，磷酸二氫鉀添加量為0.15%，培養基初始含水量為65%，在此優化發酵條件下，進行3次平行驗證試驗，發酵培養物中靈芝三萜含量實際值為0.367%，與預測值相差不大，比未優化前提高了0.013%。

3 結論

本次研究通過單因素試驗，以靈芝三萜產量為評價指標，考察了酵母浸出粉添加量、培養基初始含水量、磷酸二氫鉀添加量對固態發酵結果的影響，并通過響應面分析優化確定靈芝固態發酵三七渣生產靈芝三萜的培養基制備條件為：采用過60目篩的中藥渣，酵母浸出粉添加量為2.5%，磷酸二氫鉀添加量為0.15%，培養基初始含水量為65%。在此優化發酵條件下，發酵培養物中靈芝三萜含量為0.367%，比優化前提高了0.013%。