不同酵母對(duì)干白葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中香氣變化的影響

馬云青，孫佳勰，畢玉杰，崔彥志，康文懷，秦 玲

（1.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.朗格斯酒莊（秦皇島）有限公司，河北 秦皇島 066600）

葡萄酒香氣主要來(lái)源于葡萄原料、發(fā)酵過(guò)程及葡萄酒陳釀階段[1-2]。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母發(fā)揮了重要作用，主要體現(xiàn)在酵母能將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化成酒精和二氧化碳，促進(jìn)高級(jí)醇、甘油、醛、酯等代謝物質(zhì)大量產(chǎn)生，從而決定了葡萄酒的色澤、香氣、口感，對(duì)其品質(zhì)具有重要影響[3-4]。不同酵母代謝產(chǎn)物存在差異，從而賦予葡萄酒不同的風(fēng)味特征[5-6]。張美枝等[7]用酵母EC1118、Str和CEC01發(fā)酵霞多麗干白葡萄酒發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，EC1118有較高的產(chǎn)酸能力，而CEC01導(dǎo)致總酸、總酚含量下降，表現(xiàn)出較高的降酸能力。余歡等[8]用7株酵母發(fā)酵桂葡3號(hào)干白葡萄酒發(fā)現(xiàn)，漢遜酵母屬的Hanseniaspora thailandicaMSF1-4有較高的產(chǎn)辛酸乙酯能力，根據(jù)香氣物質(zhì)的總量和香氣活力值（odor activity value，OAV）表明，畢赤酵母屬的Pichia pastorisMG1產(chǎn)香能力最好。目前針對(duì)不同酵母對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的香氣變化研究較多，但對(duì)發(fā)酵過(guò)程中香氣的變化研究報(bào)道較少。

因此，本試驗(yàn)以霞多麗葡萄為原料，選用兩種不同釀酒酵母進(jìn)行干白葡萄酒發(fā)酵試驗(yàn)，采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）研 究不同酵母對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的香氣物質(zhì)變化，并運(yùn)用主成分分析法對(duì)發(fā)酵過(guò)程不同階段的香氣進(jìn)行分析，以期為探究發(fā)酵過(guò)程中葡萄酒風(fēng)味特征的變化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葡萄原料（霞多麗糖度167.50 g/L（以葡萄糖計(jì)），酸度3.90 g/kg（以酒石酸計(jì)））：2019年采自張家口；LA DELICIEUSE（簡(jiǎn)稱LA-DE）、LA PERSANE（簡(jiǎn)稱LA-PE）釀酒酵母：煙臺(tái)帝伯仕啤酒技術(shù)有限公司。

果膠酶（60 000 U/mL）、偏重亞硫酸鉀（食用級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。C8～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30μmSPEM萃取頭（DVB/CAR/PDMS）：美國(guó)SupeLco公司；Agilent 7890B/5977A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)Agilent公司；PAL RSI 85多功能氣相色譜自動(dòng)進(jìn)樣裝置：瑞士CTC公司；FC5718R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Ohaus公司；ME104E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干白葡萄酒發(fā)酵工藝流程

1.3.2 測(cè)定方法

（1）基本理化指標(biāo)

參照GB/T 1503—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]中的方法進(jìn)行。所有指標(biāo)均重復(fù)3次，并取其平均值。

（2）香氣物質(zhì)分析[10-11]

樣品預(yù)處理：取適量不同發(fā)酵時(shí)期干白葡萄酒發(fā)酵液，12 000 r/min離心處理10 min，取上清液待測(cè)。

HS-SPME條件：準(zhǔn)確量取8mL上清液加入含有2.4gNaCl的20 mL進(jìn)樣瓶中，再加入8 μL 2-辛醇內(nèi)標(biāo)（1 000 μg/L）溶液。迅速密封后置于磁力攪拌加熱臺(tái)上，在50 ℃條件下保持30 min，然后將已經(jīng)活化或熱解吸后的SPME萃取頭插入樣品瓶的頂空部分。吸附飽和后的萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸5 min，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測(cè)分析。

GC-MS測(cè)定條件：所用載氣為高純氦氣（He），載氣流速為1 mL/min；固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣，采用不分流模式；控制進(jìn)樣口溫度為250 ℃，熱解吸5 min；升溫程序?yàn)?0 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。質(zhì)譜接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為電子電離源（electron ionization，EI），電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為30～350 m/z。

定性方法[11-12]：待測(cè)香氣采用質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）法和保留指數(shù)（retention index，RI）法進(jìn)行定性分析。MS法：通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行檢索匹配，其匹配率均大于80%；RI法：測(cè)得C8～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)樣和發(fā)酵樣品中各香氣物質(zhì)色譜峰的保留時(shí)間（retention time，RT），計(jì)算其保留指數(shù)，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中的保留指數(shù)和查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行物質(zhì)定性[10-11]。

定量方法[11-12]：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Agilent ChemStation軟件對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行定性和定量，使用Microsoft Excel 2010對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類及繪制相關(guān)曲線圖，使用SPSS 17.0對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中基本理化指標(biāo)變化

由圖1A、圖1B可知，不同酵母發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液還原糖和可溶性固形物的變化均呈逐漸下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵第0～2天（發(fā)酵前期），還原糖和可溶性固形物含量開(kāi)始緩慢下降，這是因?yàn)榘l(fā)酵前期酵母生長(zhǎng)繁殖緩慢，糖消耗速率較慢；第3～7天（發(fā)酵中期）繼續(xù)下降且速率加快，說(shuō)明酵母代謝比較旺盛，將大量的糖轉(zhuǎn)化為酒精等；發(fā)酵第8～9天（發(fā)酵后期）持續(xù)下降并趨于平穩(wěn)。第9天酒精發(fā)酵結(jié)束，糖含量基本穩(wěn)定降至4 g/L以下。LA-DE酵母發(fā)酵液發(fā)酵前期、中期消耗速率低于LA-PE酵母發(fā)酵液，發(fā)酵后期糖含量變化趨于一致，表明LA-PE酵母在發(fā)酵過(guò)程中酒精發(fā)酵啟動(dòng)速度較快。

圖1 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中還原糖（A）、可溶性固形物（B）及總酸含量（C）變化Fig.1 Changes of reducing sugar (A),soluble solid (B) and total acid contents (C) in different yeasts fermentation process

由圖1C可知，LA-DE酵母發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液總酸含量呈逐漸增加的趨勢(shì)；第9天時(shí)達(dá)到最大值6.84 g/L，隨后終止發(fā)酵。LA-PE酵母發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液總酸含量第0～4天呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)并在第4天達(dá)到最大值6.47 g/L；第5～9天在一定范圍內(nèi)上下波動(dòng)；第9天時(shí)為6.19 g/L。這與趙雪平等[13]的研究結(jié)果一致；兩種酵母發(fā)酵結(jié)束后其發(fā)酵液總酸含量均大于葡萄汁總酸含量（3.90 g/L），且酵母LA-DE發(fā)酵液中總酸含量（6.84g/L）高于酵母LA-PE發(fā)酵液（6.19g/L）。

2.2 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液香氣物質(zhì)的變化

2.2.1 葡萄汁與發(fā)酵液中不同香氣種類的變化

由表1可知，在兩種酵母整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，共檢測(cè)出68種香氣物質(zhì)，其中酯類32種，醛類4種，醇類3種，酸類7種，萜烯類13種，酚類3種，其他類6種。葡萄汁中香氣物質(zhì)較少，為31種；而LA-DE、LA-PE酵母發(fā)酵液中較多，分別為59種和63種。相比于葡萄汁，LA-DE、LA-PE酵母發(fā)酵液中酯類、醇類、酚類、萜烯類、酸類物質(zhì)種類均呈增加趨勢(shì)，而醛類物質(zhì)種類略有減少。

表1 兩種酵母發(fā)酵過(guò)程中的香氣物質(zhì)含量Table 1 Aroma substances contents in two kinds of yeasts fermentation process

續(xù)表

酯類物質(zhì)是葡萄酒中一類重要的香氣，來(lái)源于葡萄果實(shí)、發(fā)酵過(guò)程及陳釀過(guò)程[16]，賦予葡萄酒果香和花香[17]。LA-DE酵母發(fā)酵液中酯類物質(zhì)總含量為22 787.88 μg/L；LA-PE酵母發(fā)酵液中酯類物質(zhì)總含量為14 569.57 μg/L。其中癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯等含量較高，分別占酯類物質(zhì)總含量的30.37%、24.23%，19.68%、21.41%，13.69%、11.66%，12.87%、11.23%。醇類物質(zhì)是由酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生，是構(gòu)成葡萄酒風(fēng)味特征的基本香氣。兩種酵母對(duì)發(fā)酵液中醇類物質(zhì)影響較為明顯，酵母LA-PE發(fā)酵液中醇類含量為2 587.30 μg/L，占總量13.37%，明顯高于酵母LA-DE（1 545.53 μg/L）。酸類物質(zhì)主要來(lái)源于發(fā)酵副產(chǎn)物和葡萄漿果[19]。LA-DE酵母發(fā)酵液中酸類總含量為2 643.42 μg/L，占總量9.57%；LA-PE發(fā)酵液中含量為1 595.20 μg/L，占總量8.24%。萜烯類物質(zhì)作為葡萄酒中一種重要的香氣，它感官閾值（OAV）非常低[20]，所以其含量會(huì)影響葡萄酒的香氣特征[21]。酵母LA-DE發(fā)酵液中萜烯類總含量為409.49 μg/L，占總量的1.48%，較高于酵母LA-PE（389.16 μg/L），與葡萄汁相比含量分別增加1.86、1.77倍。酚類物質(zhì)是葡萄中重要的抗氧化類化合物[22]。酵母LA-DE發(fā)酵液中酚類總含量為173.87 μg/L，占總量的0.63%；酵母LA-PE發(fā)酵液中其含量為150.85 μg/L，占總量的0.78%。

癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸和正癸酸等香氣物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中始終存在，且含量在不同階段有不同變化；月桂酸乙酯、辛酸乙酯、十六烷酸乙酯和己酸乙酯等香氣物質(zhì)在發(fā)酵的過(guò)程中逐漸產(chǎn)生，且含量變化顯著，這與陳明等[15]的研究相類似。

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)主成分分析

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，以特征值＞1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率＞80%，兩個(gè)指標(biāo)確定主成分個(gè)數(shù)為2，其中酵母LA-DE結(jié)果中PC1解釋了總方差的64.80%，PC2解釋了總方差的22.61%；酵母LA-PE結(jié)果中PC1解釋了總方差的63.53%，PC2解釋了總方差的27.17%。主成分分析表明，前2個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率分別達(dá)到87.40%、90.70%，基本包含了重要指標(biāo)具有的信息，可以用來(lái)進(jìn)行后續(xù)分析[24]。

由圖2A可知，同一酵母發(fā)酵過(guò)程發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前3 d香氣物質(zhì)出現(xiàn)明顯分化，發(fā)酵后期聚集在了一起，說(shuō)明在發(fā)酵初始階段香氣物質(zhì)變化較為顯著，發(fā)酵3 d后趨于一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)，香氣物質(zhì)的變化幾乎沒(méi)有影響葡萄酒的主體香氣，這與孫佳勰等[12，25]研究結(jié)果相一致。不同酵母發(fā)酵過(guò)程相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酵母LA-DE和LA-PE發(fā)酵過(guò)程中第1天、第3天、第9天香氣物質(zhì)出現(xiàn)明顯差異，而第5天、第7天差異較小。表明不同酵母發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的香氣物質(zhì)變化趨勢(shì)相似但也存在差異，所以可以通過(guò)香氣物質(zhì)的主成分分析區(qū)分不同的釀酒酵母。

圖2 兩種酵母發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)主成分分析Fig.2 Principal component analysis of aroma substances in two kinds of yeasts fermentation processes

載荷系數(shù)反映了發(fā)酵過(guò)程中各香氣物質(zhì)對(duì)主成分的影響，載荷系數(shù)絕對(duì)值越大，表明該香氣物質(zhì)對(duì)主成分的貢獻(xiàn)也越大。由圖2B可知，酵母LA-DE發(fā)酵過(guò)程中對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)較大的是（E）-β-大馬士酮、正癸酸、鄰苯二甲酸二異辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙醇、（E）-2-己酸，而月桂酸乙酯對(duì)第一主成分呈負(fù)面影響；對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)較大的是癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、正癸酸、苯乙醇、9-癸烯酸乙酯、辛酸。酵母LA-PE發(fā)酵過(guò)程中對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)較大的是（E）-β-大馬士酮、鄰苯二甲酸二異辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、正癸酸、（E）-2-己酸、2,4-二叔丁基苯酚、苯乙醇；對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)較大的是癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸、苯乙醇、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、正癸酸、十六烷酸乙酯。通過(guò)主成分分析，揭示了具體香氣物質(zhì)對(duì)葡萄酒主體香氣的貢獻(xiàn)大小，以獲得不同酵母關(guān)鍵性香氣物質(zhì)組成。

3 結(jié)論

兩種釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的還原糖和可溶性固形物均呈下降趨勢(shì)，總酸含量均大于葡萄汁總酸含量；葡萄汁和發(fā)酵液中共檢測(cè)出68種香氣物質(zhì)。相比于葡萄汁，酵母LA-DE和LA-PE發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中醇類、酯類、酸類、萜烯類和酚類物質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，而醛類物質(zhì)逐漸減少；其中酯類物質(zhì)含量增加顯著，發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為22 787.88 μg/L和14 569.57 μg/L。主成分分析結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中香氣物質(zhì)在前3 d變化較為明顯，兩種酵母發(fā)酵液在第1天、第3天、第9天香氣物質(zhì)差異明顯。由此可知，采用不同酵母發(fā)酵葡萄酒香氣物質(zhì)種類和含量發(fā)生了一定變化，其特征香氣物質(zhì)也因酵母的不同而存在差異，這對(duì)生產(chǎn)風(fēng)味特色鮮明的葡萄酒具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。鑒于葡萄酒的主體香氣還受香氣物質(zhì)自身閾值的影響，因此，在發(fā)酵過(guò)程中不同酵母對(duì)其主體香氣的影響還需進(jìn)一步研究，葡萄酒的感官分析工作將于后期開(kāi)展，為進(jìn)一步確定不同酵母發(fā)酵葡萄酒的感官特征提供科學(xué)依據(jù)。