基于模擬胃消化對小米黃酒抗氧化活性的影響

郭佳垚，張 偉，李倩倩，武佳文，趙廉謙，郝 林

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西雁門山酒業有限公司，山西 忻州 034200）

黃酒作為世界上最古老的酒之一，始于商周時代，且不同地域的黃酒風格各不相同[1-2]。黃酒經長時間糖化發酵，原料中的大分子物質轉化為易被人體吸收的小分子物質，且在發酵過程會產生一些具有特殊功能的生物活性物質，加之其酒溫性順、體豐味醇，越來越成為大眾群體消費的主流[3-7]。

細胞是構成生命的基本單位，而自由基通過奪取外部電子造成了對機體細胞的損傷，加速了人體衰老。因此人體通過攝入外界的抗氧化物質來提高其免疫防御系統，以維持體內的平衡[8-9]。宋云剛[10]對香菇紅曲黃酒的體外抗氧化活性進行了研究，羥自由基、超氧陰離子自由基和1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-bitterhydrazine，DPPH）自由基的清除率分別在發酵第12、14、16天達到最高，水平分別為88%、72%和92%。但一般的體外抗氧化實驗與真實的生理環境有所差異，因此不能科學的體現產品在人體內消化后的抗氧化活性。模擬體外消化模型是一種更加接近真實環境的研究方法，相對于小鼠消化試驗模型是一種易實施、低成本的研究手段[11-14]。近年來，越來越多的學者、研究人員增加胃消化對酒抗氧化活性的研究進展。如王靜等[15]采用體外模擬胃腸消化對獼猴桃果漿和果汁消化前后抗氧化活性進行對比，其中鐵還原力以及DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除率在模擬胃消化后均有所提高。張燦等[16]采用模擬消化對青麥仁餅干消化前后抗氧化活性進行了研究，DPPH自由基清除率顯著增加，2,2'-聯氨-二-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfphonate），ABTS）自由基清除率和羥基自由基清除率先降低后增加。本試驗為了研究小米黃酒在消化前后抗氧化活性的變化，嘗試通過模擬胃腸消化可以快速準確的對食物中功能成分的作用有著更全面科學的評價，對小米黃酒的抗氧化作用進行更全面科學的評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米黃酒（酒精度15.4%vol、總糖34.4 g/L、總酸6.03 g/L、氨基酸態氮0.64 g/L）：山西農業大學生物工程實驗室釀造；胃蛋白酶（3 000 U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司；DPPH（分析純）：上海藍季生物有限公司；鹽酸（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：天津市北聯精細化學品開發有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：福晨（天津）化學試劑有限公司；磷酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；三氯乙酸、氯化鈉（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ZWY-103B恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HH-4數顯電子恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；PHS-3C酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；UV-5300紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃消化試驗

模擬胃液的配制[17-18]：采用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解166.67 mg胃蛋白酶，配制成5 000 U/mL的模擬胃液。

參考胡義東等[8，16]的方法并稍作修改，設置3組試驗：

（1）模擬胃消化組：取15 mL小米黃酒，用0.1 mol/L鹽酸溶液將其pH調節至2.0，再加入3 mL模擬胃液，經模擬胃消化2 h；

（2）空白對照組：為控制與試驗組體系一致，取15 mL小米黃酒，用0.1 mol/L鹽酸溶液將其pH調節至2.0，再加入3 mL模擬胃液，經模擬胃消化0 h；

（3）胃酸對照組：為了區分酸環境和酶環境的影響，以未加胃蛋白酶、加等體積等濃度鹽酸溶液的小米黃酒經模擬胃消化2 h為胃酸對照組；

以上三組試驗在37℃、140 r/min的恒溫水浴搖床中振蕩，取出適量消化液3 500 r/min離心15 min，-20 ℃條件下保存。

1.3.2 模擬胃消化技術路線

在A點處表示小米黃酒原液的抗氧化活性；在B點處表示空白對照組的抗氧化活性；在C點處表示模擬胃消化組、胃酸對照組的抗氧化活性。經模擬胃消化環境后，為保持與試驗組體系一致，故用（C-B）值表示小米黃酒經模擬胃消化抗氧化活性的變化量。

1.3.3 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率參照LARRAURI J A等[19]的方法進行測定；還原能力測定參照DUAN X等[20-21]的方法進行測定；超氧陰離子自由基清除率參照HU T T等[22]的方法進行測定；羥自由基清除率參照繆冰旋[23]的方法并稍作修改，進行測定。所有指標均以同質量濃度VC溶液作為陽性對照。

1.3.4 樣品處理

酒樣處理：量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL的小米黃酒分別用蒸餾水定容至1mL，即酒樣濃度為0.1 mL/mL、0.2 mL/mL、0.3 mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL、0.6 mL/mL、0.8 mL/mL和1.0 mL/mL。

消化液處理：量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的消化液分別用0.9%生理鹽水定容至1mL，即消化液濃度為0.1mL/mL、0.2mL/mL、0.3mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL、0.6 mL/mL、0.8 mL/mL和1.0 mL/mL。

1.3.5 數據處理

所有指標均重復測定3次，結果以平均值±標準差（X±SD）表示。利用Excel 2016軟件處理數據，用Origin 9.0軟件進行數據作圖。采用SPSS20.0軟件分析方法中的Duncan's多重比較進行數據分析，以P＜0.05表示差異顯著性分析。通過SPSS 20.0軟件建立回歸方程，選擇Probit分析，計算得出半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）[24]。

2 結果與分析

2.1 小米黃酒體外抗氧化活性

如圖1所示，隨著小米黃酒酒樣濃度的提高，DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率和還原能力呈上升趨勢。當酒樣濃度為0.1～0.2 mL/mL，酒樣DPPH自由基清除率差異顯著；當酒樣濃度在0.3～0.5 mL/mL時，酒樣對DPPH自由基清除率低于VC，酒樣的DPPH自由基清除率最高可達93.99%。當酒樣濃度為0.4～1.0 mL/mL時，酒樣超氧陰離子自由基清除率差異不顯著，清除率略低于VC，酒樣的超氧陰離子自由基清除率最高可達78.23%。當酒樣濃度為0.1～0.5 mL/mL時，酒樣還原能力差異顯著，酒樣還原能力最高為1.015。當酒樣濃度為0.1～0.2 mL/mL時，酒樣羥自由基清除率差異顯著，略低于VC；酒樣濃度在0.3～0.5 mL/mL時，酒樣對羥自由基清除率略高于VC，酒樣的羥自由基清除率最高可達90.96%。結果表明，小米黃酒在清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除率和還原能力方面與VC相當。

圖1 小米黃酒的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of millet Huangjiu

2.2 模擬胃消化后小米黃酒的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率

如圖2所示，小米黃酒經過模擬胃消化2 h后DPPH自由基清除率較強，當消化液濃度為0.1 mL/mL時，模擬胃消化組和胃酸對照組的DPPH自由基清除率分別為（58.32±1.78）%和（53.11±1.39）%，說明模擬酸環境對DPPH自由基清除率影響大于酶環境對其的影響；隨著消化液濃度的升高，模擬胃消化組差異顯著，消化液與DPPH自由基配對后，DPPH自由基清除率逐漸升高，當消化液濃度為0.5 mL/mL時，模擬胃消化組和胃酸對照組的DPPH自由基清除率分別為（88.90±2.47）%和（78.36±2.31）%。此濃度時，模擬胃消化組對比空白對照組的DPPH自由基清除率提高了76.87%，其IC50值為66 μL/mL。胃液中蛋白酶酶解產物由于存在疏水性氨基酸或短肽物質，有利于降低DPPH自由基清除率[25]。消化液濃度范圍為0.1～0.5 mL/mL時，模擬胃消化組DPPH自由基清除率＞胃酸對照組＞空白對照組。

圖2 小米黃酒模擬胃消化前后的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of millet Huangjiu before and after stomach digestion

2.2.2 還原能力

如圖3所示，當消化液濃度為0.1 mL/mL時，空白對照組和模擬胃消化組的還原能力分別為0.052±0.001和0.094±0.001；隨著消化液濃度的升高，各組別的還原能力逐漸上升差異顯著，當消化液濃度為0.5 mL/mL時，模擬胃消化組和胃酸對照組的還原能力分別為0.309±0.001和0.289±0.002，說明模擬酸環境對還原能力的影響大于酶環境對其的影響，且部分供氫氨基酸可以增加樣液的還原能力[26]。此時，模擬胃消化組對比空白對照組的還原能力增加了0.223，在空白對照組的基礎上提高了259.30%。消化液濃度范圍為0.1～0.5 mL/mL時，模擬胃消化組還原能力＞胃酸對照組＞空白對照組。

圖3 小米黃酒模擬胃消化前后的還原能力Fig.3 Reduction ability of millet Huangjiu before and after stomach digestion

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率

如圖4所示，模擬胃消化組的超氧陰離子自由基清除率均較強，當消化液濃度為0.2 mL/mL時，模擬胃消化組的超氧陰離子自由基清除率為（71.05±8.79）%，消化液與自由基結合反應，從而阻止有色中間物質的產生，隨著消化液濃度的升高，自由基清除率呈上升趨勢。其中，胃酸對照組的超氧陰離子自由基清除率相對穩定。當消化液濃度為0.8 mL/mL時，模擬胃消化組和胃酸對照組的超氧陰離子自由基清除率分別為（78.91±2.82）%和（75.33±2.55）%，模擬胃消化組對比空白對照組的超氧陰離子自由基清除率提高了68.43%，模擬胃消化組的IC50值為5 μL/mL。消化液濃度范圍為0.2～1.0 mL/mL時，超氧陰離子自由基清除率：模擬胃消化組＞胃酸對照組＞空白對照組。

圖4 小米黃酒模擬胃消化前后的超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of superoxide anion radical of millet Huangjiu before and after stomach digestion

2.2.4 羥自由基清除率

如圖5所示，當消化液濃度為0.1 mL/mL時，模擬胃消化組和胃酸對照組的羥自由基清除率分別為（50.79±0.33）%和（47.73±0.26）%，說明模擬酸環境對羥自由基清除率的影響大于酶環境對其的影響。隨著消化液濃度的升高，羥自由基清除率呈上升趨勢且差異顯著。當消化液濃度為0.5 mL/mL時，模擬胃消化組的羥自由基清除率為（78.67±0.15）%，對比空白對照組的羥自由基清除率提高了57.92%，其IC50值為90 μL/mL。消化液濃度范圍為0.1～0.5 mL/mL時，羥自由基清除率：模擬胃消化組＞胃酸對照組＞空白對照組。

圖5 小米黃酒模擬胃消化前后的羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rate of millet Huangjiu before and after stomach digestion

3 結論

通過對小米黃酒模擬胃消化前后抗氧化活性的變化規律進行研究分析，小米黃酒有著較強的還原能力和清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力。在模擬胃消化2 h后，小米黃酒的DPPH自由基清除率提高了76.87%，羥自由基清除率提高了57.92%，超氧陰離子自由基清除率提高了68.43%，還原能力提高了0.223。本試驗證明，經過模擬胃消化后的小米黃酒在消化液濃度范圍內的抗氧化活性明顯提高，小米黃酒具有較強的抗氧化活性。