提高郫縣豆瓣甜瓣子品質的工藝條件優化

李 峰，馮 霞，黃家全，張蓓蓓，劉 義，陳麒名，張玲利，陳宏毅

（1.四川省食品發酵工業研究設計院有限公司，四川 成都 611130；2.四川省微生物資源平臺菌種保藏管理中心，四川 成都 611130；3.四川省郫縣豆瓣股份有限公司，四川 成都 611730）

郫縣豆瓣是以蠶豆、鮮辣椒、面粉等為原料的半開放式傳統發酵調味品，是中國地理標志產品，是川菜特色調味料，其制作技藝獲國家級非物質文化遺產名錄。郫縣豆瓣的制作需要通過制曲、甜瓣子發酵、辣椒鹽漬發酵、后發酵等關鍵工藝過程[1-2]，其中利用蠶豆和面粉制作甜瓣子是豆瓣生產的關鍵工藝，決定產品的氨基酸態氮含量、風味及色澤，是影響豆瓣品質的關鍵因素。豆瓣曲發酵好后，加入鹽水進行發酵，在發酵過程中醬醪產生甜香氣息和味道，當地人稱其為甜瓣子。目前，郫縣豆瓣甜瓣子的制作大部分采用米曲霉（Aspergillus oryzae）Q3.042制曲，然后以14%～16%的鹽分進行保溫發酵的單菌種高鹽分發酵工藝，存在滋味咸鮮單薄，色澤偏暗的問題[3-4]。目前對郫縣豆瓣品質的研究主要集中在揮發性成分方面，雷丹等[5]研究不同原料預處理對品質的影響、胡延等[6]通過添加酵母強化甜瓣子的研究都著重在工藝對豆瓣揮發性成分影響方面的研究；在制曲方面的研究有陳延延等[7]采用米曲霉和黑曲霉共同培養制曲提高成曲酶活力、孟甜等[8]在郫縣豆瓣制曲生化變化進行發酵機理的研究，但在理化指標與品質的關系及影響方面研究較少。本研究從郫縣豆瓣生產過程中篩選出的性能優良菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）SICC3.1083和SICC3.930進行種曲制作，然后按不同比例混合后進行豆瓣制曲和甜瓣子發酵，通過對甜瓣子的理化指標還原糖、總酸、氨基酸態氮、紅色指數與甜瓣子品質指標中的色、香、味之間的關系進行分析研究。以感官評價為響應值，在單因素試驗的基礎上，采用統計軟件Design-Expert 10.0.4中響應面法的Box-Behnken試驗設計[9-10]，對種曲比例、甜瓣子發酵溫度、鹽分等發酵條件進行優化，改善豆瓣曲酶系的均衡性，提高甜瓣子還原糖、氨基酸態氮和紅色指數等理化指標，使甜瓣子滋味甜鮮醇厚協調，色澤紅亮達到提高甜瓣子品質目的[7-8]，為郫縣豆瓣新產品開發和后發酵提供優質的甜瓣子，為提高郫縣豆瓣品質提供理論和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）SICC3.556、SICC3.930、SICC3.800、SICC3.1083、黑曲霉（Aspergillusniger）SICC3.318、米根霉（Rhizopus oryzae）SICC3.622和對照菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）Q3.042：四川省微生物資源平臺菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

福林酚試劑、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：北京索萊寶科技有限公司。121 ℃滅菌20 min。

種曲培養基：將麩皮按料液比1.0∶0.9（g∶mL）加水，混勻后裝入300 mL三角瓶，每三角瓶裝料20 g，用紗布、牛皮紙包好后，121 ℃滅菌40 min。

固態發酵培養基：蠶豆于沸水中漂燙2～3 min冷卻后，添加20%～25%面粉混勻。

1.2 儀器與設備

ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PhS-5酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；TU-1810紫外分光光度計：普析通用儀器有限責任公司；SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備部；85-2磁力攪拌器：常州越新儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將試驗用菌株分別接入PDA斜面于28～30 ℃恒溫活化培養96～120 h，斜面長滿孢子后放置于冰箱冷藏備用。

1.3.2 甜瓣子加工工藝流程及操作要點

操作要點：

種曲制備：將活化好的菌種SICC3.556、SICC3.930、SICC3.800、SICC3.1083、SICC3.318、SICC3.622和對照菌株Q3.042接入已滅菌的種曲培養基中，置28～30 ℃恒溫培養箱培養，待麩皮長滿白色菌絲后扣瓶繼續培養，培養120 h待麩皮長滿黃綠色孢子后，種曲培養結束，置于45 ℃干燥箱中干燥備用。

豆瓣制曲：稱取適量蠶豆瓣，在沸水中漂燙2～3 min，冷卻后拌入20%～25%的面粉，將種曲預先拌入面粉中，種曲量按原料的5‰加入，拌合均勻置恒溫培養箱中培養，培養溫度28～30 ℃，相對濕度90%，曲料中心溫度達37 ℃翻曲，待蠶豆瓣長滿黃綠色孢子后收曲，制曲時間96 h。

發酵：將發酵成熟的豆瓣曲稱質量，按照料液比1.0∶1.0（g∶mL）添加熱鹽水，發酵鹽分14%，保溫45 ℃發酵35 d結束發酵，得到甜瓣子。

1.3.3 復合種曲篩選試驗

將活化好的菌種分別制作種曲，然后制備豆瓣曲并進行甜瓣子發酵，檢測豆瓣曲蛋白酶、淀粉酶、糖化酶活力及甜瓣子理化指標并進行感官評價；然后分別將種曲按質量比1.0∶1.0（g∶g）混合進行豆瓣制曲及甜瓣子發酵，檢測豆瓣曲蛋白酶、淀粉酶、糖化酶活力及甜瓣子理化指標并進行感官評價，篩選出性能優良的復合種曲。

1.3.4 甜瓣子發酵工藝條件優化

（1）單因素試驗

將米曲霉種曲按比例混合，以5‰接種量接入蠶豆固體培養基中，28～30 ℃恒溫培養制曲96 h，按照料液比1.0∶1.0（g∶mL）添加熱鹽水，發酵鹽分14%，保溫45 ℃發酵35 d結束發酵。分別進行甜瓣子感官評價和還原糖、紅色指數、總酸、氨基酸態氮含量的檢測，確定最佳發酵工藝條件。單因素試驗因素與水平見表1。

表1 甜瓣子工藝條件優化單因素試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor experiments for process conditions optimization of sweet bean petals

（2）響應面法試驗設計

根據發酵過程中各單因素對甜瓣子品質影響結果分析，選取對感官評價影響較大的3個因素種曲比例（A）、發酵溫度（B）、鹽分（C）為自變量，以感官評價（Y）為響應值，采用Box-Behnken響應面設計試驗，試驗因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factor and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 分析檢測

（1）種曲酶活力檢測

蛋白酶活力參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[11]；淀粉酶活力、糖化酶活力參照GB 1886.174—2016《食品工業酶制劑》[12]。

（2）甜瓣子理化指標檢測

總酸、氨基酸態氮、鹽分參照GB/T 20560—2006《地理標志產品郫縣豆瓣》[13]。還原糖參照食品中還原糖的測定[14]。

（3）甜瓣子紅色指數檢測

紅色指數：采用比色法測定。取剁碎樣品5 g加入50 mL蒸餾水，浸泡30 min定容至100 mL后離心，取上清液于波長610 nm處測其光密度值（OD610nm）標為D1，于波長510 nm處測光密度值（OD510nm）標為D2，紅色指數計算公式如下[15]：

式中：x為紅色指數；D1為波長610 nm條件下的光密度值；D2為波長510 nm條件下的光密度值。

（4）感官評價

參照郫縣豆瓣和甜面醬的感官要求[16]，結合甜瓣子的特性進行制定試驗甜瓣子的評價標準。選取10位有經驗的調味品品評員，從色澤、香味、滋味、體態四個方面進行評分，評分標準見表3。

表3 甜瓣子感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standards of sweet bean petals

1.3.6 數據處理方法

采用Design Expert 10.0.4軟件中的Box-Behnken試驗設計進行響應面分析，試驗均重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 種曲菌株篩選

2.1.1 不同菌株種曲制備豆瓣曲的各種酶活力

為了更好的利用微生物資源，試驗菌株采用米曲霉、黑曲霉和米根霉進行研究，其中SICC3.318為黑曲霉，SICC3.622為米根霉，SICC3.556、SICC3.930、SICC3.800和SICC3.1083為米曲霉。不同菌株種曲制備豆瓣曲的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶酶活力測定結果見圖1。

圖1 不同菌株種曲制備甜瓣子各種酶類酶活力比較Fig.1 Comparison of enzyme activities of various kinds of enzyme of sweet bean petals prepared by different strains koji

由圖1可知，豆瓣曲中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力最高的是菌株3.1083，分別為1 982 U/g和1 869 U/g，豆瓣曲酸性蛋白酶最高的是菌株3.318，為1 256 U/g，豆瓣曲淀粉酶和糖化酶活力最高的是菌株3.930，分別為400 U/g和2 036 U/g，其中菌株3.556、3.930、3.1083是豆瓣曲蛋白酶活力較高的菌種，蛋白酶是分解原料中蛋白質形成氨基酸類和多肽類物質是甜瓣子風味物質形成的主要前體物質[17]，菌株3.622和3.800所制豆瓣曲綜合酶活都較對照菌株3.042弱。

2.1.2 不同菌株種曲制備甜瓣子的氨基酸態氮含量和感官評價

不同菌株種曲制備甜瓣子的氨基酸態氮含量和感官評價結果見圖2。

圖2 不同菌株種曲制備甜瓣子感官評價和氨基酸態氮含量的比較Fig.2 Comparison of sensory evaluation and amino acid nitrogen contents of sweet bean petals prepared by different strains koji

由圖2可知，菌株3.318氨基酸態氮含量最高達0.92g/100g，其中菌株3.1083的氨基酸態氮含量達0.80 g/100 g，對照菌株Q3.042氨基酸態氮含量為0.65 g/100 g；在感官評價中菌株3.318的醬醪色澤發黑且沒有醬香味，不具備甜瓣子的感官特征，菌株3.1083甜瓣子色澤棕褐色色澤較深，咸鮮味重，菌株3.930甜瓣子色澤紅亮甜鮮，菌株3.622在制曲過程中由于生長緩慢感染環境中米曲霉，導致氨基酸態氮含量和感官評價偏低，其他菌株生長速度快，能形成優勢菌抵御雜菌感染。

2.1.3 混合菌株種曲制備豆瓣曲的各種酶活力

將各單菌株種曲按1.0∶1.0（g∶g）混合進行豆瓣曲制備，混合種曲制備豆瓣曲其各種酶酶活力測定結果見圖3。

圖3 不同混合菌株種曲制備甜瓣子各種酶類酶活力比較Fig.3 Comparison of activities of various kinds of enzyme of sweet bean petals prepared by different mixed strains koji

由圖3可知，菌株3.1083與3.556混合發酵的豆瓣曲蛋白酶酶活最高（4 241 U/g），糖化酶活力為1 072 U/g，菌株3.1083與3.930混合發酵的豆瓣曲其蛋白酶活力為3 495 U/g，糖化酶活力達1 635 U/g，糖化酶活力明顯提高。

2.1.4 混合菌株種曲制備甜瓣子的氨基酸態氮含量和感官評價

將混合菌株種曲制備豆瓣曲進行甜瓣子發酵，甜瓣子氨基酸態氮含量和感官評價結果見圖4。

圖4 不同混合菌株種曲制備甜瓣子感官評價和氨基酸態氮含量的比較Fig.4 Comparison of sensory evaluation and amino acid nitrogen contents of sweet bean petals prepared by different mixed strains koji

由圖4可知，菌株3.318與其他米曲霉混合發酵甜瓣子的氨基酸態氮含量都比較高，但是甜瓣子沒有醬香味且醬醪色澤黑褐色，黑曲霉在試驗中的應用失敗還需要進一步的研究；菌株3.1083與3.930混合發酵甜瓣子感官評分為85分，氨基酸態氮含量為0.74 g/100 g，菌株3.1083與3.556混合發酵的甜瓣子氨基酸態氮含量為0.76 g/100 g，感官評價分為80分，在色澤評價中菌株3.1083與3.930混合發酵甜瓣子紅潤有光澤，菌株3.1083與3.556混合發酵的甜瓣子色澤棕褐色，顏色發暗；在香味評價中菌株3.1083與3.930混合發酵甜瓣子醇香突出，菌株3.1083與3.556混合發酵的甜瓣子醬酯香味突出；在滋味評價中菌株3.1083與3.930混合發酵甜瓣子醬香濃郁甜鮮醇厚，滋味飽滿協調，菌株3.1083與3.556混合發酵的甜瓣子醬香濃郁，味鮮美，滋味欠協調；在體態評價中菌株3.1083與3.930混合發酵甜瓣子瓣形完成醬醪濃稠，菌株3.1083與3.556混合發酵的甜瓣子瓣形完整醬醪略顯干澀。因此，菌株3.1083與3.930種曲組合可以彌補單一菌種中酶系不均衡，達到提高甜瓣子品質的目的，可進一步優化發酵工藝條件。

2.2 工藝條件優化單因素試驗

2.2.1 混合種曲比例對甜瓣子感官評價和還原糖含量的影響

還原糖在甜瓣子的發酵過程中參與色澤和風味物質的形成，是甜瓣子非常重要的指標。在豆瓣制曲過程中米曲霉產生糖化酶和淀粉酶，可將原料中的淀粉分解成糊精和還原糖，還原糖可以被微生物利用形成醇類和酯類等風味物質，醇類物質對甜瓣子香氣貢獻較大，是醇香的主要來源，也是形成酯類物質的前提；還原糖與氨基酸產生美拉德反應形成色素，豐富的糖類物質與氨基酸均衡使甜瓣子飽滿協調滋味豐富[18-19]。

由表4可知，不同比例的混合種曲發酵甜瓣子的還原糖和感官評價不同，還原糖的提高可以形成更多風味物質，改善單一菌種單調的咸鮮，有利于提高郫縣豆瓣甜瓣子品質[20-23]。在種曲比例為1.0∶1.0時感官評價最高，為88.5分，且還原糖含量較高7.76%。因此，選擇最佳菌株3.1083和3.930質量比為1.0∶1.0。

表4 菌株3.1083和3.930質量比對甜瓣子感官評價和還原糖含量的影響Table 4 Effect of strain 3.1083 and 3.930 mass ratio on sensory evaluation and reducing sugar content of sweet bean petals

2.2.2 發酵溫度對甜瓣子感官評價和紅色指數的影響

甜瓣子發酵可采用常溫發酵也可采用保溫發酵，保溫更利于酶的充分作用，提高發酵速度縮短發酵時間[24]；甜瓣子色澤主要來源于發酵過程中，葡萄糖和氨基酸經過一系列反應最終產生呈棕紅色的類黑素物質。發酵溫度的提高有利于色素的形成，過高的溫度會造成甜瓣子焦糊味重風味變差[25]。由表5可知，不同發酵溫度對甜瓣子的色澤的影響，隨著發酵溫度逐漸提高，甜瓣子的色澤逐漸變深褐色，在發酵溫度為40 ℃時，甜瓣子的色澤及醬香味等感官評價指標達到最佳，為88.0分；當發酵溫度高于45 ℃之后，甜瓣子的香氣變弱，由于溫度升高導致酶活力降低，微生物作用下降，導致氨基酸損失及色澤變差。因此，選擇最佳發酵溫度為40 ℃。

表5 發酵溫度對甜瓣子感官評價和紅色指數的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation and red index of sweet bean petals

2.2.3 發酵時間對甜瓣子感官評價和總酸含量的影響

甜瓣子總酸在發酵初期增加速度快，之后上升緩慢，與氨基酸態氮變化趨勢一致，國外學者在研究韓國黑豆醬發酵過程中理化指標的變化與試驗結果一致[26]；隨著發酵時間延長，風味物質的積累越豐富。由表6可知，在發酵時間25 d時，甜瓣子醬香濃郁，色澤紅亮，滋味甜鮮醇厚，感官評分為88.2分，隨著時間延長總酸緩慢增加，過高的酸度會影響發酵辣椒醅的色澤。因此，選擇最佳發酵時間為25 d。

表6 發酵時間對甜瓣子感官評價和總酸含量的影響Table 6 Effect of fermentation time on sensory evaluation and total acid content of sweet bean petals

2.2.4 發酵鹽分對甜瓣子感官評價的影響

在發酵食品中，微生物的差異導致發酵成分的差異，在甜瓣子發酵過程中鹽水濃度的高低對甜瓣子發酵影響顯著，適宜的鹽水濃度在甜瓣子發酵過程中起到抑制雜菌感染的目的，過高的鹽水濃度也會抑制豆瓣曲中各種酶的活性及微生物作用[27]。由表7可知，8%發酵鹽分由于鹽分過低導致大量腐敗菌繁殖，醬醪酸度迅速上升，且醬醪酸敗發酵異常；14%發酵鹽分對蛋白酶作用的抑制非常明顯，氨基酸態氮下降，過高過低的發酵鹽分對甜瓣子風味的影響都不利[28-29]，12%鹽分將有利于提高發酵速度，產生更多的氨基酸態氮，提高產品品質。因此，選用最佳鹽分為12%。

表7 鹽分對甜瓣子感官評價和氨基酸態氮含量的影響Table 7 Effect of salt content on sensory evaluation and amino acid nitrogen content of sweet bean petals

2.3 響應面試驗結果及分析

2.3.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，固定發酵時間為25 d，選取對氨基酸態氮含量影響較大的3個因素菌株3.1083和3.930質量比（A）、發酵溫度（B）、鹽分（C）為自變量，以感官評價（Y）為響應值，根據Box-Behnken設計方案進行試驗，響應面試驗結果見表8，方差分析見表9。

表8 Box-Behnken試驗設計與結果Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

感官評價對以上因素二次多元回歸模型為：

2.3.2 方差分析

回歸模型的方差分析如表9所示，模型P＜0.000 1，模型回歸極顯著，失擬項P=0.137 6＞0.05，差異不顯著，說明模型對優化甜瓣子感官評價的發酵工藝是合適的；決定系數R2為0.997 7，模型對感官評價預測值與試驗值擬合程度較高，調整決定系數為R2Adj為0.994 6，模型能解釋99.4%響應值的變化，因此，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。對模型回歸方程系數顯著性檢驗，得到模型一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2（P＜0.01）差異性顯著；模型所選的3個因素中，根據F值大小其影響的強弱為：菌株3.1083與3.930質量比＞鹽分＞發酵溫度。

2.3.3 各因素交互作用對氨基酸態氮含量的響應面分析

根據回歸方程繪制響應面曲面和等高線，能直觀地反映各因素及其交互作用對響應值的影響，結果見圖5。

圖5 各因素相互作用對感官評價影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between each factors on sensory evaluation

為了更好地研究各變量之間的關系和進一步確定最優方案，通過Design-Expert10.0.4軟件繪制響應面進行可視化分析。響應面的曲線圖中，各因素間交互作用越強，曲線走勢越陡，其交互作用越顯著；等高線的形狀也反應交互作用的強弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形則交互作用小；由圖5可知，種曲比例和鹽分的響應面坡度較陡，等高線橢圓度較大，表明兩因素交互作用強，對感官評價的影響顯著；3個因素對響應面的敏感程度中種曲比例對感官評價作用最顯著，其次是鹽分，最后是發酵溫度，這與方差分析結果一致。

2.3.4 驗證實驗與結果分析

為驗證模型預測的準確性，對響應面優化工藝進行驗證，為便于試驗實際操作，將參數調整為菌株3.1083和3.930質量比1.0∶1.0，發酵溫度40 ℃，鹽分12.0%。在此優化工藝條件下進行5次平行試驗，所得感官評分平均實際值為88.5分，實際值為與預測值88.2分相近，說明該回歸方程能較準確反應各因素對感官評價的影響。

2.4 工藝優化前后甜瓣子理化指標分析及品質評價

優化前后工藝對照見表10，優化前后甜瓣子理化指標和感官評價對照見表11。

表10 優化前后工藝對照Table 10 Process comparison before and after optimization

表11 甜瓣子品質評價Table 11 quality evaluation of sweet clovers

由表10、11可知，優化后發酵溫度和鹽分降低，發酵時間縮短，感官評分提高17%、氨基酸態氮含量提高20%、還原糖含量提高40%、和紅色指數提高40%；工藝條件和理化指標都優于傳統工藝，感官評分明顯提高，甜瓣子色澤紅亮醇香鮮甜，滋味較傳統工藝豐富協調。將不同性能菌株制作種曲然后按比例混合制豆瓣曲有利于改善豆瓣曲酶系的均衡性，增加風味物質的協調性，可以達到提高甜瓣子品質的目的。

3 結論

良好的品質是理化指標相互作用、相互協調，理化指標是工藝條件的體現。試驗篩選出的功能菌種米曲霉SICC3.1083、SICC3.930綜合酶活力優于米曲霉Q3.042；利用混合種曲制曲發酵提高甜瓣子品質，采用響應面法優化發酵工藝，得到最佳發酵工藝條件為：混合種曲（米曲霉3.1083和3.930）質量比1.0∶1.0（g∶g），發酵溫度40 ℃，鹽分12%。在此優化條件下，郫縣豆瓣甜瓣子感官評分88分，還原糖含量為7.76 g/100 g，氨基酸態氮含量為0.78 g/100 g，理化指標均優于傳統發酵工藝，品質提升顯著；有效縮短發酵時間，降低發酵溫度，提高生產效率，降低生產能耗，表明菌種SICC3.1083和SICC3.930混合發酵具有應用價值。