發酵過程中添加磷酸氫二銨對蘋果酒香氣物質的影響

郭 麗，王鐵儒，馬 曼，王冰宜，魏新元，樊明濤

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

蘋果酒是以蘋果汁為原料經發酵而成的含酒精飲料，富含氨基酸、有機酸等多種營養物質，因其酒精度低和適口性良好而深受消費者喜愛[1]。但由于我國蘋果酒發展起步較晚，在蘋果酒釀造中仍存在一些問題，如發酵過程中果汁褐變引起的果酒顏色變化、酒體口味單薄及香氣不足等。如何解決這些問題，成為蘋果酒釀造關注的重點。香氣物質是果酒品質的重要組成部分，是決定果酒風味和典型性的重要因素[2]。目前關于提升蘋果酒香氣的研究多集中在酵母菌種的選擇[3-4]和發酵工藝的優化等[5-6]方面，關于氮源對蘋果酒香氣影響的研究較少。

氮是酵母生長和代謝必不可少的元素。在酒精發酵過程中，酵母吸收和代謝氮元素和其他營養物質，以支持酵母生長和香氣物質的合成[7-8]。氮源不足會導致發酵遲緩，并產生一些風味不好的物質（如H2S）[9]。為保證發酵的順利進行和提升酒的香氣，一般在酒中添加氮源，如磷酸氫二銨（dibasic ammonium phosphate，DAP）或氨基酸，且添加氮對果酒香氣的影響因酵母菌種[10]、發酵基質組成[11-12]和添加時間[10，13]而不同。在目前的研究中，由于發酵條件的不同，關于氮對果酒香氣的影響無法得出比較一致的結論，如TORREA D等[11]研究發現發酵前添加DAP顯著降低了霞多麗酒中高級醇的含量，但SEGUINOT P等[14]研究發現，發酵前在合成葡萄汁中添加DAP對異戊醇和異丁醇沒有影響；此外，SEGUINOT P等[14]研究發現，在穩定期添加氮更有利于揮發性香氣物質的合成，尤其是乙酸酯類物質，但GUTIERREZ A等[10]研究發現，在穩定期添加氮對酯類物質的影響不顯著。因此，關于氮對蘋果酒香氣的影響需要做進一步的研究。

本試驗以富士蘋果為原料，研究在發酵前、酵母生長對數期和穩定期前期分別添加DAP對酵母發酵性能和蘋果酒香氣物質的影響，以期提高蘋果酒的品質特性，并為蘋果酒釀造中氮源添加的最優時間提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果：陜西楊凌農貿市場；釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）WLP775：西北農林科技大學食品微生物與生物技術實驗室鑒定保藏；磷酸氫二銨（食品級）：江蘇紫東食品有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；白砂糖（食品級）：成都太古糖業有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉（分析純）、亞硫酸（分析純）：四川西隴科學有限公司；有機酸標品（蘋果酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、琥珀酸）（均為色譜純）、無水葡萄糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2-辛醇（純度98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 000 mL。固體培養基另加入20 g瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

HausElec離心果汁機：南通金橙機械有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；BL-50A立式滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；LC-2030 PLUS高效液相色譜儀（highperformanceliquidchromatography，HPLC）、QP2010 Ultra氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司；手動固相微萃取（50/30 μm DVB/CAR/SPME）進樣器：美國Supelco公司；DB-17MS毛細管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將甘油管中保存的酵母菌株接種于10 mL YPD液體培養基中，28 ℃培養48 h，再以2%接種量在YPD液體培養基中連續轉接2次，離心（5 000×g，5 min）收集菌體沉淀，生理鹽水洗滌后接種到蘋果汁中進行發酵。

1.3.2 蘋果酒釀造工藝流程、操作要點及試驗設計

操作要點：選擇無病變、成熟度好的蘋果進行切分榨汁后，分裝到用硫熏過的發酵罐中，并加入亞硫酸，添加量為1 mL/L。按50 mg/L的量加入果膠酶室溫酶解12 h后，添加白砂糖調整成分，使蘋果汁初始可溶性固形物的含量為20 °Bx，然后接入活化好的酵母在20 ℃條件下進行發酵。發酵期間每天測定酵母生物量和還原糖含量，當還原糖降為4 g/L以下，且連續3 d不再變化時，發酵結束。然后用8層無菌紗布過濾酒樣，置于-20 ℃冰箱保存。

根據酵母生長曲線，分別在發酵前（發酵0 h，記為D0）、酵母生長對數期（發酵24 h，記為D24）和穩定期前期（發酵72 h，記為D72）添加280 mg/L的DAP，并設置對照（不添加DAP，記為CK）。每個試驗重復3次，結果取平均值。

1.3.3 酵母生物量測定

采用平板計數法。發酵期間每天取樣，梯度稀釋后在YPD固體培養基上涂布，28 ℃培養48 h后進行計數。

1.3.4 還原糖含量測定

還原糖測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[15]。即將樣品稀釋后，依次取1 mL樣品、1 mL蒸餾水和2 mL DNS 試劑于25 mL具塞比色皿中，沸水浴5 min后流水冷卻至室溫，定容至25 mL后在波長540 nm處測定吸光度值，以葡萄糖為標品繪制標準曲線，利用樣品相應吸光度值對比標準曲線回歸方程計算還原糖含量。

1.3.5 有機酸含量測定[16]

采用高效液相色譜法對酒樣中的有機酸進行定性和定量測定。蘋果酒樣用0.22 μm濾膜過濾后進行測定，ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.01 mol/L磷酸氫二銨（pH 2.7），進樣量：10 μL，等梯度洗脫，流速：0.7 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：210 nm。

1.3.6 揮發性香氣物質測定[17]

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對揮發性香氣物質進行檢測。取5 mL待測酒樣于15 mL頂空萃取瓶中，添加6 μL 2-辛醇（質量濃度為0.45 mg/mL，溶于甲醇）作為內標，加入1 g NaCl后旋緊瓶蓋，于40 ℃條件下平衡15 min，插入已老化的萃取頭萃取30 min。萃取完畢后，迅速取下萃取器，插入氣相色譜儀進樣口于260 ℃條件下解吸3 min。

GC-MS條件：色譜柱升溫程序為起始溫度40 ℃，保持3 min后以4 ℃/min 的速度升溫至120 ℃，再以6 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持12 min。載氣為高純氦氣（He），不分流進樣，流速1.0 mL/min。進樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35～400 u，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV。

香氣物質的定性和定量方法：檢測出的未知化合物經計算機自動檢索與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）library、Wiley library相匹配，選擇匹配度＞85%的物質作為有效香氣成分，結合文獻中的保留指數進行香氣物質的定性[18]；以2-辛醇為內標（質量濃度0.45 mg/mL），按內標法計算各成分質量濃度實現定量。

1.3.7 數據處理

利用SPSS 20.0對數據進行差異顯著性檢驗（Duncan檢驗），采用Minitab 18.0進行主成分分析，采用Graphpad繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中添加DAP對發酵速率和酵母生長的影響

不同處理下蘋果酒發酵速率及酒中酵母數的動態變化如圖1所示，用還原糖消耗情況來表示發酵速率。如圖1A所示，在發酵過程中添加DAP均能加快發酵速率，但在穩定期添加DAP對酵母數影響不大，這與SEGUINOT P等[14]的研究結果一致，添加DAP處理組還原糖含量在第5天時就降到4 g/L以下，且在第8天時完成發酵，而未添加DAP的對照組發酵終止需要9 d。在發酵前2 d，D0處理組還原糖消耗速率和酵母數顯著高于其它試驗組，這說明初始氮濃度是促進酵母生長和還原糖消耗的關鍵因素[19]。如圖1B所示，發酵到第3天時，所有處理酵母數均達到最大值，發酵前和對數期添加DAP處理組測得的酵母數分別為7.63 lg（CFU/mL）和7.62 lg（CFU/mL），高于CK和D72的7.32 lg（CFU/mL）和7.35 lg（CFU/mL），隨后，D0和D24處理組酵母數快速下降，這可能是因為發酵蘋果汁大多數還原糖和氮源被酵母耗盡所致[10]。

圖1 發酵過程中蘋果酒發酵速率（A）和酵母數（B）的動態變化Fig.1 Dynamic changes of fermentation rate (A) and of yeast cell content (B) in cider during fermentation process

2.2 發酵過程中添加DAP對蘋果酒有機酸含量的影響

不同處理下蘋果酒中部分有機酸含量如表1所示，發酵結束后，在所有酒樣中琥珀酸和蘋果酸占總有機酸含量的85%以上。發酵前和對數期添加DAP均顯著降低了琥珀酸的含量（P＜0.05），在葡萄酒和荔枝酒中也有相似的結論[11，20]，琥珀酸含量降低可減弱酒中的咸味和苦味，對蘋果酒的感官有積極影響[21]；與CLEMENT T等[13]的研究相反，在穩定期添加DAP顯著增加了琥珀酸的含量，同時降低了蘋果酸的含量。琥珀酸是在厭氧條件下由蘋果酸轉化而成的[22-23]，所以推測在穩定期添加DAP促進了蘋果酸向琥珀酸轉化反應的進行。L-蘋果酸是二元羧酸，含量過高會使酒口感酸澀，降低其含量可使蘋果酒口感更加柔和。無水檸檬酸含量受DAP添加時間的影響較大，對數期添加DAP顯著增加了無水檸檬酸的含量，而在穩定期前期添加DAP顯著降低了其含量（P＜0.05）。發酵過程中添加DAP顯著降低了酒石酸的含量（P＜0.05），其中在穩定期前期添加時降低的作用更顯著。草酸和L-乳酸在蘋果酒樣中的含量較低，在穩定期前期添加DAP顯著降低了草酸的含量，在對數期添加DAP顯著增加了L-乳酸的含量（P＜0.05）。

表1 發酵過程中蘋果酒有機酸含量的動態變化Table 1 Dynamic changes of organic acids contents in cider during fermentation process

2.3 發酵過程中添加DAP對蘋果酒揮發性香氣物質的影響

不同處理下蘋果酒揮發性香氣物質的含量如表2所示。由表2可知，蘋果酒中共檢出25種香氣物質，包括7種醇類、5種酸類和13種酯類，其中乙酯類8種，乙酸酯類5種。在所有酒樣中，D72處理組的總香氣含量最高，為11.09 mg/L，其次為D0處理組，總香氣含量為9.77 mg/L，D24處理組香氣含量最低，為7.38 mg/L。

表2 發酵過程中蘋果酒揮發性香氣物質含量的動態變化Table 2 Dynamic changes of volatile aroma compounds contents in cider during fermentation process

不同處理下蘋果酒中各類香氣物質含量如圖2所示，在所有酒樣中，含量最高的是乙酯類香氣物質，其次為醇類物質。在發酵前和穩定期前期添加DAP均顯著增加了酒中乙酯類香氣物質的含量，且D72處理組含量最高；所有添加DAP處理組均顯著降低了酒中醇類物質的含量，D24處理組醇類物質含量最低；此外，只有D72處理組顯著增加了乙酸酯的含量，發酵前添加DAP對乙酸酯沒有顯著影響（P＜0.05），對數期添加DAP降低了酒中乙酸酯的含量；添加DAP處理組都增加了酒中酸類物質的含量，D0和D72處理組沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 發酵過程中蘋果酒各類香氣物質含量的動態變化Fig.2 Dynamic changes of aroma substances contents in cider during fermentation process

由表2可知，在所有醇類中，含量最高的是異戊醇，其次是異丁醇，發酵過程中添加DAP都顯著降低了這兩種物質的含量（P＜0.05），在酵母生長階段，氨和其前體物質α-酮酸會生成酵母所需的氨基酸，但這兩種物質都在穩定期才開始合成[24]，因此，在發酵前和對數期前期添加DAP顯著降低了這兩種物質的含量（P＜0.05）；在穩定期添加銨激活了與氨基酸合成有關的基因LEU1、LEU2、BAT1和BAT2的表達[25]。此外，在穩定期添加DAP顯著增加了酒中2,3-丁二醇和苯乙醇的含量，2,3-丁二醇具有果香和甜香，苯乙醇具有玫瑰香和蜂蜜香，可改善蘋果酒香氣。

酸類物質是α-酮酸經過脫羧反應生成相應的醛類，醛類再由乙醛脫氫酶氧化形成相應的酸[26]。乙醛氧化脫羧形成酸還是還原形成醇取決于細胞內氧化還原電勢。發酵過程中添加DAP都顯著增加了己酸、辛酸和癸酸的含量，這可能是因為DAP促進酵母產生更多的還原性輔酶Ⅰ，從而使醛氧化成酸[27]。

酯類種類繁多，包括乙酯類和乙酸酯類，含量占總揮發性化合物的一半以上，對蘋果酒果香和花香有重要貢獻。由表2可知，發酵前和對數期添加DAP對乙酸乙酯和己酸乙酯沒有顯著影響，但在穩定期添加DAP顯著增加了己酸乙酯的含量。另外，發酵前和穩定期添加DAP都顯著增加了辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯含量（P＜0.05），穩定期添加增加的效果更顯著。在對數期添加DAP對乙酸酯幾乎沒有影響，發酵前添加DAP顯著增加了乙酸己酯和乙酸庚酯的含量（P＜0.05），穩定期添加DAP顯著增加了乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯的含量（P＜0.05）。有研究表明，乙酸酯的合成主要取決于醇酰基轉移酶的活性，在穩定期添加銨能夠使編碼該酶的基因ATF1和ATF2表達量顯著上調[14]。

2.4 主成分分析

為了更好地解釋發酵過程中添加DAP對蘋果酒揮發性香氣的影響，對各類揮發性香氣化合物（醇類、酸類、乙酯類和乙酸酯類）進行了主成分分析，結果見圖3。

圖3 發酵過程中蘋果酒揮發性化合物主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile compounds in cider during fermentation process

PC1解釋了65.7%的變量，PC2解釋了32.8%的變量，累計貢獻率為98.5%。乙酯類和酸類物質位于PC2的正向端，且距離酒樣D0較近，說明發酵前添加DAP能夠顯著增加酒樣中乙酯類和酸類物質的含量；此外，乙酯類和乙酸酯類物質位于PC1正向端，距離酒樣D72較近，說明穩定期前期添加DAP有利于乙酯類和乙酸酯類物質的生成。

3 結論

本試驗分析了在發酵前、酵母生長對數期和穩定期前期添加DAP對酵母發酵性能和蘋果酒香氣物質的影響。在發酵前和對數期前期添加DAP加快了發酵速率，并增加了酵母數量，但在穩定期添加DAP僅加快發酵速率，對酵母數無影響。香氣分析表明，對數期添加DAP對蘋果酒香氣物質影響不顯著，盡管發酵前和穩定期前期添加DAP對蘋果酒香氣的影響表現出一定的相似性，但在穩定期前期添加DAP對蘋果酒香氣物質含量的提升效果更顯著，尤其對酯類物質，所以穩定期前期是添加DAP的最優時間。本研究可為蘋果酒品質特性的改善及氮源在果酒中的應用提供理論依據。關于不同時間添加DAP對蘋果酒香氣調節的機理有待進一步研究。