基于外觀性狀及內在成分的龍膽藥材等級劃分

吳曉燕，翁麗麗，宿瑩，劉戰，姜雨昕，孫金，李翟，侯曉琳（長春中醫藥大學藥學院，長春 130117）

龍膽始載于《神農本草經》，列為中品，為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabraBge.）、條葉龍膽（G.manshuricaKitag.）、三花龍膽（G.triflorapall.）或滇龍膽（G.rigescensFranch.）的干燥根及根莖[1]。龍膽為傳統常用大宗藥材，性味苦、寒；歸肝、膽經；主要化學成分為環烯醚萜類化合物，具有清火燥濕、瀉肝膽火、清熱健胃等作用；臨床上主要應用于治療濕熱黃疸、帶下、濕疹瘙癢、肝火目赤、耳鳴耳聾等癥狀[2-3]。龍膽主產于黑龍江、吉林、遼寧等地，國內外市場對龍膽的需求量呈逐年上升趨勢，藥用資源開發潛力巨大。

中藥材等級不僅是評價藥材質量的重要依據，也是影響藥材價格高低的主要因素。中藥商品規格代表了人們對中藥品質的一種認識，且其品質與臨床發揮的療效密切相關，是近幾年中藥研究領域中的熱點問題[4-6]。目前市場上流通的龍膽藥材主要來源于龍膽科龍膽的干燥根及根莖，野生龍膽資源很少，多為人工栽培龍膽，故本研究所用龍膽均為人工栽培龍膽科龍膽的干燥根及根莖。關于龍膽等級劃分，目前使用最多的是1984年頒布的《七十六種藥材商品規格標準》[7]，距今已有30多年，參考指標較少、等級劃分不明確。當前市面上，存在將龍膽藥材及飲片不分等級全部混合統裝現象，難以實現優質優價。2020年版《中國藥典》一部中規定以龍膽苦苷為評價藥材質量的指標性成分，由于不同產地龍膽品質各有差異，其他成分含量也不盡相同，以單一成分作為指標并不能全面反映藥材質量。因此，本研究利用現代分析技術及統計學方法，在傳統外觀性狀指標基礎上，增加色度指標，并加入體現龍膽內在成分的指標——水溶性浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷進行等級標準研究，為初步制訂龍膽藥材等級標準提供更加全面的劃分依據。

1 材料

1.1 儀器

Prominence-ILC-2030型高效液相色譜儀（島津企業管理中國有限公司）；NH300型電腦色差儀（深圳三恩馳科技有限公司）；FA1004B型萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JA2603B型千分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（長春弘揚科技有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（色譜純，Fisher Chemical），磷酸（色譜純，天津市光復精細化工研究所），水為超純水。龍膽苦苷對照品（批號：110770-201716，純度：97.6%）、馬錢苷酸對照品（批號：111865-201704，純度：97.4%）、獐牙菜苦苷對照品（批號：110785-201404，純度：98.3%）（中國食品藥品檢定研究院）。

45批龍膽藥材由吉林省北藥藥材加工有限公司收集，分別產自黑龍江大興安嶺（編號L01～L21）、黑龍江小興安嶺（編號L22～L30）、吉林省撫松縣（編號L31～L40）、遼寧省清源滿族自治縣（編號L41～L45），經長春中醫藥大學翁麗麗教授鑒定，均為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabra）的干燥根及根莖。

2 方法與結果

2.1 藥材長度、須根數、直徑、粉末色度測量

45批龍膽藥材樣品，每批隨機選取5根完整的藥材，采用游標卡尺測量根莖至根末端的長度，取平均值；數須根數，取平均值；采用游標卡尺測量根上（根莖）、中（簇生根中部）、下（簇生根尾部）3部分直徑，取平均值。粉末色度測定條件為：可選光源為D65，8度視場，4 mm測定孔徑，LED 藍光激發，儀器誤差：△E*ab≤0.4。取龍膽樣品（過四號篩），按照以上色度測定條件進行樣品顏色測定，對儀器進行黑白板校正以后，測定L*，a*，b*值，每個樣品重復測定3次，計算每份樣品的平均總色差值，總色差值（E*ab）＝（L*2＋a*2＋b*2）1/2。藥材外觀性狀具體測量結果見表1。

表1 龍膽藥材外觀性狀測定結果Tab 1 Determination of appearance characteristics of Gentiana

2.2 水溶性浸出物

照2020年版《中國藥典》四部通則2201項下的熱浸法測定45批龍膽藥材水溶性浸出物，結果見表2。

2.3 龍膽苦苷含量測定

照2020年版《中國藥典》一部龍膽含量測定項下規定的龍膽苦苷的含量測定方法，對45批龍膽藥材用高效液相色譜儀測定，高效液相色譜圖見圖1，測定結果見表2。

2.4 馬錢苷酸、獐牙菜苦苷含量測定

2.4.1 色譜條件 依利特Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長：240 nm；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL；流速：1.0 mL·min－1；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～33 min，5%→7%A；33～40 min，7%→8%A；40～50 min，8%→95%A；50～60 min，95%→5%A）。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸0.10 mg、獐牙菜苦苷0.05 mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.4 線性關系考察 按“2.4.2”項下方法制備不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，mg·mL－1）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。馬錢苷酸的回歸方程為y＝3.62×105x＋3.75×104，r＝0.9998；獐牙菜苦苷回歸方程為y＝1.04×105x－1.94×103，r＝0.9999，兩成分在各自的質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積積分值，結果馬錢苷酸對照品峰面積積分值RSD值為0.80%，獐牙菜苦苷對照品RSD值為0.83%。表明方法精密度良好。

2.4.6 重復性試驗 精密稱取同一批樣品共6份，按“2.4.3”項下方法處理后進樣測定。結果馬錢苷酸峰面積積分值RSD值為1.6%，獐牙菜苦苷峰面積積分值RSD值為1.5%，表明方法重現性良好。

2.4.7 穩定性試驗 精密稱取供試品，按“2.4.3”項下方法制備成供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，進樣測定，記錄峰面積積分值。結果馬錢苷酸峰面積積分值RSD值為0.70%，獐牙菜苦苷對照品峰面積積分值RSD值為0.61%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.4.8 加樣回收試驗 稱取已知含量的樣品共6份，分別精密加入對照品適量，依法測定，計算回收率。結果馬錢苷酸平均回收率為100.3%，RSD值為0.40%；獐牙菜苦苷平均回收率為100.1%，RSD值為0.78%。表明方法準確度良好。

2.4.9 樣品含量測定 取45批龍膽藥材，按“2.4.3”項下方法制備成供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄馬錢苷酸、獐牙菜苦苷的峰面積，計算樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷的含量，高效液相色譜圖見圖2，測定結果見表2。

表2 龍膽浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷測定結果Tab 2 Determination of extract，gentiopicrin，marcinoside and swertiamain

圖2 對照品（A）及供試品（B）色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of control（A）and sample（B）

2.5 藥材外觀性狀與內在成分的相關性分析

采用SPSS 21.0軟件對45批龍膽藥材長度、須根數、直徑、色度、浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸及獐牙菜苦苷含量進行Pearson相關性分析，結果見表3。龍膽的內在成分水溶性浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸及獐牙菜苦苷含量與外觀性狀藥材長度、須根數、直徑及總色差值成顯著正相關，龍膽藥材長度越長、須根數越多、直徑越粗、顏色越淺，龍膽的內在成分（包括浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苦苷）的含量越高。

表3 Pearson相關性分析結果Tab 3 Pearson correlation analysis

2.6 藥材質量等級劃分

根據外觀性狀及內在成分含量多個指標的相關性，采用SPSS 21.0軟件，以藥材長度、須根數、直徑、總色差值、浸出物、龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷的含量作為分級指標變量進行K-均值聚類分析，最終聚類中心值見表4，45批藥材樣品可劃分為兩個等級，結果見圖3，L01～L14、L16、L22～L34、L41為一等；L15、L17～L23、L35～L40、L42～L45為二等，以最終聚類中心值作參考，制訂龍膽藥材等級劃分標準，見表5。

表4 K-均值聚類分析的最終聚類中心值Tab 4 Final cluster center value of K-mean cluster analysis

表5 龍膽藥材質量等級劃分Tab 5 Quality classification of Gentiana

圖3 K-均值聚類分析樹狀圖Fig 3 Tree diagram of K-means cluster analysis

3 討論

中藥的性狀判定是傳統質量評價主要形式，但傳統性狀評價具有很大的主觀性。近年來，色差儀在中藥材顏色的量化檢測中受到廣泛應用[7-10]。本研究采用色差儀測量龍膽藥材粉末色度，比肉眼觀察顏色深淺更為精準。吳翠[11]研究發現，5-羥甲基糠醛普遍存在于中藥中，其含量與藥材的色澤、年份存在相關性，一些藥材貯存時間越久，貯存或加工溫度越高，5-羥甲基糠醛的含量越高，藥材顏色也越深，有效成分也就越低。本研究表明，龍膽藥材顏色越深，其龍膽苦苷等有效成分含量越低，由此猜測，這可能與其采收加工或貯存時間、貯存時的溫度有關，后續研究可以考慮增加5-羥甲基糠醛的測定驗證這一猜想。

根及根莖類藥材在植物藥中所占比例大，在中藥中占有舉足輕重的地位。該類藥材傳統上主要按照基原、產地、部位、采收加工方法等劃分規格，并主要以可以方便掌握的性狀作為劃分依據[12-14]。中藥成分的復雜多樣決定了單一成分的含量不能全面反映藥材質量，必須采用多成分、多指標進行綜合質量分析[15]。本研究在對龍膽質量進行傳統研究的基礎上，增加了內外指標的聯系，通過K-均值聚類分析初步劃定了較明確的等級范圍，制訂的標準從外在品質到內在品質均更加全面、具體，對龍膽藥材等級劃分及規范性貯存等具有積極意義，也為其他根及根莖類中藥的等級劃分提供了很好的思路。后期可以增大樣品量及樣品產地來源，以期利用現代先進科技手段，盡最大可能地保障和控制龍膽的質量，從而篩選優良龍膽藥材資源，更好地實現藥材的優質優價。