基于UPLC多指標成分含量測定的柴胡不同部位質量評價研究

周麗娟，孫欣光*，王雅芝，3，王玉龍，楊曉寧*（.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 00085；.山西振東道地藥材開發有限公司，山西 長治 04700；3.遵義醫科大學藥學院，貴州 遵義 563000）

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumwilld.的干燥根，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效[1]。研究表明，柴胡具有解熱、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調節等藥理作用[2-4]。柴胡中主要含有皂苷、黃酮、揮發油、多糖等成分[2，5-6]，其中柴胡皂苷為其主要活性成分，也是目前評價柴胡質量的主要指標成分[4]。柴胡具有顯著的臨床療效而被廣泛使用，含柴胡的中成藥品種約500個[7]，《中國藥典》2015年版及增補版收載含柴胡中成藥品種共105個，常見品種有柴黃片、柴胡疏肝丸、小柴胡泡騰片、小柴胡顆粒、柴胡疏肝丸等[8]。

由于柴胡藥材的市場需求量較大，導致柴胡藥材資源短缺，曾出現供不應求的局面。目前柴胡藥材野生資源很少，市場上流通的柴胡藥材以栽培品種為主，且大多會保留部分地上殘莖。柴胡的藥用部位為根，文獻報道柴胡莖葉與根的化學成分存在差異[6]，但關于地上殘莖的化學成分研究鮮有報道，地上殘莖與根之間主要柴胡皂苷類成分的含量差異情況不明確，從而導致市場流通的柴胡藥材質量參差不齊，影響其療效。

多指標的含量測定來評價柴胡藥材質量的研究已有報道，但所需對照品用量大，價格昂貴且難以獲得。一測多評（quantitative analysis of multi-components by single-maker，QAMS）以中藥中某一種成分對照品為內參物，利用相對校正因子實現多指標成分的同時測定，可以很好地解決這類難題[9-14]，被《中國藥典》收載用于多種中藥的多成分含量測定及質量評價，具有重要的指導意義[15]。

本研究建立QAMS法同時測定柴胡藥材根和地上殘莖中6種柴胡皂苷成分的含量，以柴胡皂苷d為內參物，建立其與柴胡皂苷a、b2、c、e和f的相對校正因子，并計算5種柴胡皂苷的含量；采用外標法（ESM）驗證QAMS的可行性和準確性，最終建立QAMS法測定柴胡藥材中6 種主要皂苷成分的含量，并測定 8批柴胡藥材根及殘莖不同分段部位中6種成分的含量，比較各柴胡皂苷成分差異，闡明地上殘莖對柴胡藥材質量的影響，為柴胡藥材的質量控制提供新的方法和依據。

1 材料

1.1 試藥

柴胡皂苷a（批號：110777-201912，含量：94.8%）、柴胡皂苷d（批號：110778-201912，含量：96.3%）（中國食品藥品檢定研究院）；柴胡皂苷b2（批號：7383，含量：99.6%）、柴胡皂苷c（批號：4237，含量：100%）、柴胡皂苷e（批號：4157，含量：99.9%，）、柴胡皂苷f（批號：6131，含量：99.7%）（施丹德生物科技有限公司）；色譜乙腈（批號：JB091230，默克）；色譜甲醇（批號：5021403，上海星可高純溶劑有限公司）；氨水（批號：20200302，福晨化學試劑有限公司）；純水（Milli-Q 制備）。

1.2 藥材

不同產地的柴胡藥材，經山西醫科大學高建平教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根及少量地上殘留莖，其產地來源信息見表1，均購自安國藥材市場。帶有地上殘莖的柴胡藥材從蘆頭處分開，分為根和殘莖兩部分；殘莖從蘆頭處開始分為莖0～1 cm（J1）、莖1～2 cm（J2）、莖2 cm以上（J3）三部分，根從蘆頭處開始分為根0～1 cm（G1）、根1～2 cm（G2）、根2 cm以下（G3）三部分。

表1 柴胡藥材樣品來源信息表Tab 1 Source information of Bupleuri Radix

1.3 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class 系統（PDA 檢測器，Waters 公司）；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；TLE204/02電子天平、XSE205DU電子天平（METTLER TOLEDO）；電子天平（MSA36S-OCE-DH，Sartorius）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～1 min，5%A；1～2 min，5%→30%A；2～5 min，30%→32%A；5～8 min，32%→35%A；8～12 min，35%→40%A；12～15 min，40%→45%A；15～20 min，45%A）；流速0.45 mL·min－1；柱溫40℃，進樣量3 μL，檢測波長為205 nm（柴胡皂苷a、c、d、e、f）和254 nm（柴胡皂苷b2）。

2.2 對照品溶液的制備

取柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f對照品適量，分別精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.20 mg、柴胡皂苷b20.0075 mg、柴胡皂苷c 0.08 mg、柴胡皂苷d 0.30 mg、柴胡皂苷e 0.020 mg、柴胡皂苷f 0.05 mg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取柴胡藥材粉末（過3號篩），約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加含5%氨水的甲醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，用含5%氨水的甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 取空白溶液（含5%氨水的甲醇）、混合對照品溶液、供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示空白溶液在與混合對照品溶液和供試品溶液相應位置沒有色譜峰，表明空白溶液對6種皂苷成分的檢測無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

圖1 柴胡6種皂苷的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of 6 saikosaponins in Bupleuri Radix

2.4.2 線性關系、檢測限和定量限考察 取混合對照品儲備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下方法檢測，以柴胡皂苷進樣量（x）與峰面積（y）繪制標準曲線。以信噪比S/N為 3∶1時的質量濃度為檢測限和S/N為10∶1時的質量濃度為定量限，結果見表2。

表2 線性范圍Tab 2 Linearity

2.4.3 精密度試驗 取對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，計算柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 的峰面積RSD（n＝6），結果對照品溶液RSD分別是0.39%、0.13%、0.61%、0.14%、1.5%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批號藥材，精密稱定6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，測得含柴胡皂苷a 6.29 mg·g－1、柴胡皂苷b20.0933 mg·g－1、柴胡皂苷c 1.94 mg·g－1、柴胡皂苷d 7.86 mg·g－1、柴胡皂苷e 0.639 mg·g－1、柴胡皂苷f 1.42 mg·g－1，RSD分別為0.50%、0.43%、0.89%、0.71%、1.8%、1.4%，結果表明本方法重復性良好。

2.4.5 穩定性考察 取同一供試品溶液分別在0、4、8、12、18、24、48 h 按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f峰面積的RSD，結果為2.1%、1.7%、2.0%、1.6%、2.2%、2.6%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.4.6 準確度試驗 取柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f對照品，精密稱定，加含5%濃氨溶液的甲醇溶解，配制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.1204 mg、柴胡皂苷b20.0018 mg、柴胡皂苷c 0.0398 mg、柴胡皂苷d 0.1503 mg、柴胡皂苷e 0.0127 mg、柴胡皂苷f 0.0290 mg的回收率對照品溶液；取柴胡藥材粉末0.5 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入回收率對照品溶液25 mL（相當于藥材含量100%），按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果6種成分的回收率均在95.56%～104.91%，RSD均在0.61%～2.4%，說明本方法準確度良好。

2.5 相對校正因子測定

2.5.1 相對校正因子 采用多點校正法[16-18]，即以多個濃度點計算所得的相對校正因子的平均值作為定量用相對校正因子f，公式為Fs/k＝（Ms×Ak）/（Mk×As）（Ms為內參物質量，Mk為待測物質質量，As為內參物峰面積，Ak為待測物質峰面積）。取柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 對照品，精密稱定，加甲醇配制成混合對照品溶液，并稀釋成不同質量濃度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以柴胡皂苷d為內參物，分別計算待測成分柴胡皂苷a、b2、c、e、f 的相對校正因子，結果5個待測成分的相對校正因子分別為0.9990、4.4151、0.7235、0.9614、0.7972。

2.5.2 耐用性考察 分別考察柱溫38、42℃，流速0.40、0.50 mL·min－1對相對校正因子的影響，結果見表3。不同色譜條件下各皂苷的相對校正因子RSD均小于3.0%，耐用性良好。

表3 相對校正因子的耐用性結果Tab 3 Durability of relative correction factors

2.6 QAMS與ESM的測定結果比較

取8批市場購買的柴胡藥材，把地下部位和殘莖分開處理，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件測定，分別采用ESM和QAMS方法進行計算，結果見表4。采用SPSS 20.0軟件對兩種方法計算的結果進行t檢驗，結果兩組5個成分之間均無顯著性差異（Pssa＝0.95、Pssb2＝0.77、Pssc＝0.75、Psse＝0.94、Pssf＝0.99，均大于0.05），證明QAMS 在柴胡藥材的多指標成分質量評價中的應用是可行的。

表4 一測多評法與外標法含量測定結果(mg·g－1)Tab 4 Content determination results of QAMS and ESM (mg·g－1)

2.7 柴胡藥材不同部位皂苷類成分含量差異研究

2.7.1 柴胡藥材不同部位主成分分析 柴胡藥材不同部位皂苷類成分含量見表5。以柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 的含量為變量，采用PCA法對表5中8批柴胡藥材的根和殘留莖進行分析。PCA得分圖見圖2。整體來看，8批柴胡藥材的根和殘留莖在PCA 得分圖中可被明顯區分為2個區域。根和殘留莖被明顯區分，說明柴胡藥材的根和殘留莖在化學成分方面具有差異性。

圖2 8批柴胡藥材的PCA 得分圖Fig 2 PCA score of 8 batches of Bupleuri Radix

2.7.2 柴胡藥材皂苷類成分分布規律研究 基于上述結果，柴胡藥材殘莖中的柴胡皂苷含量要遠低于根。為研究柴胡藥材中皂苷類成分的分布規律，對市購的8批柴胡藥材根和殘莖分別進行了分段處理，檢測其中的皂苷類成分含量，結果顯示柴胡皂苷總量，柴胡皂苷a、d的總量以及柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 6個成分的含量分布規律均為：莖2 cm以上＜莖1～2 cm＜莖0～1 cm＜根0～1 cm＜根1～2 cm＜根2 cm以下，見表5、圖3。

圖3 柴胡不同部位皂苷含量Fig 3 Content of saikosaponins in different parts of Bupleuri Radix

表5 柴胡不同部位皂苷含量結果(mg·g－1)Tab 5 Content of saikosaponin in different parts of Bupleuri Radix (mg·g－1)

續表5

3 討論

3.1 色譜條件的考察

UPLC具有靈敏度高、分離度好等特點，與HPLC相比縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量，降低了分析成本，適用于解決中藥組分復雜、分離困難等問題。因此，本試驗建立了UPLC-PDA同時測定柴胡中6種皂苷含量的分析方法。對比了含5% 氨水的甲醇溶液、100%甲醇溶液對柴胡藥材中柴胡皂苷類的提取效率，結果表明含5% 氨水的甲醇溶液提取效率明顯高于100%甲醇溶液。在流動相的選擇上，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸溶劑系統，以乙腈-水為流動相時，色譜峰分離效果好，基線平穩。同時，考察了Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3種型號的色譜柱，最終發現色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對各峰分離效果優于其余色譜柱，故選擇其用于含量測定方法的建立。

柴胡皂苷a、c、d、e、f最大吸收波長為205 nm，而柴胡皂苷b2在254 nm 有最大吸收，為確保6 種柴胡皂苷均能很好地響應，綜合考慮確定在雙波長下同時測定6種柴胡皂苷的含量。

3.2 一測多評法質量評價

柴胡皂苷d是柴胡藥材的主要特征成分之一，含量較高，其對照品容易獲得，質量穩定，本試驗采用QAMS法對柴胡藥材中6種皂苷類成分進行含量測定，選用柴胡皂苷d作為內參物，對8批柴胡藥材的不同部位中6種皂苷類成分進行測定，分別采用ESM和QAMS計算，結果兩種方法差異無統計學意義，說明QAMS可以用于柴胡藥材中6種皂苷類成分的含量測定。

3.3 柴胡藥材藥用部位的討論

柴胡藥材的地上部分和地下部分的皂苷含量差異較大，地下部分皂苷含量要遠高于地上部分。文獻報道柴胡藥材的根和莖葉中的化學成分具有明顯區別[19-21]，地上部分的黃酮類成分含量較高[22-23]；另外柴胡地上和地下部分在藥效學上存在差異[24-26]，如北柴胡地下部分根具有保肝作用，而其地上部分無此作用，在解熱、抗炎等作用方面也有區別[27-29]。

本研究的8個樣品中地下部分柴胡皂苷a、d含量在0.53%～1.60%，全部符合《中國藥典》總量不得低于0.30%的規定；地上殘留莖部分只有2個樣品的柴胡皂苷a，d 總量在0.30%～0.49%，其余均不符合藥典規定，因此，地上殘留莖部分不可以作為柴胡的藥用部位。

研究發現殘莖中柴胡皂苷的含量是隨著長度的增加呈遞減趨勢的，然而即使是靠近根部的莖0～1 cm部分的6個柴胡皂苷的總量也只有地下根部的14%，建議柴胡藥材加工過程中應盡量除去殘莖，減少殘莖摻雜，保證藥材的質量。