ADRB2和NEDD4L基因多態性與高血壓晝夜節律的相關性研究

王利，張許，莊勤武，王增君，劉衛*（.聯勤保障部隊第九六〇醫院泰安醫療區，山東 泰安 27000；2.濟寧醫學院附屬醫院臨床藥學科，山東 濟寧 272000；.山東第一醫科大學第二附屬醫院臨床藥學科，山東 泰安 27000）

原發性高血壓是多基因相關疾病，不僅疾病本身有遺傳傾向，血壓晝夜節律也與遺傳有關，研究發現夜間收縮壓和夜間舒張壓異常的遺傳率分別達到56%和33%[1]。自主神經功能紊亂是導致血壓晝夜節律異常的主要原因[2]。腎上腺素能β1和β2受體對自主神經功能有重要影響，一項包含492例樣本的隊列研究表明，血壓晝夜節律的改變與β2受體（ADRB2）的A/A基因型相關，但與β1受體（ADRB1）基因多態性不相關[3]。同時，體液因素在血壓晝夜節律調節中的作用也很重要，例如限制鈉攝入可使血壓節律由非杓型轉為杓型[4]。已知腎素血管緊張素轉化酶（ACE）[5]和結構型一氧化氮合酶（eNOS）[6]的基因多態性與血壓晝夜節律改變有關，但未見鈉調節相關基因多態性對高血壓晝夜節律影響的研究報道。為此，本試驗設計了病例對照研究，考察分別對ADRB2基因和對腎鈉排泄有顯著作用的NEDD4L基因的最常見的單核苷酸（分別是rs1042713[7-8]和rs4149601[9]）多態性及其交互作用與原發性高血壓患者血壓晝夜節律異常的相關性，以期為改善血壓晝夜節律的個體化用藥提供參考。

1 方法

1.1 研究對象

納入正在治療或此前未經治療的原發性高血壓患者，研究經解放軍第九六〇醫院倫理委員會批準[批準號：（2020）科研倫理審第（48）號]，試驗對象簽署知情同意后參與研究。入院前非同日3次測量收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg。如有院外用藥，正在使用的藥物中須不包括β受體阻滯劑或利尿劑。排除標準：繼發性高血壓患者或夜班工作者；腦卒中、有糖尿病并發癥和肝腎功能不全者；不能耐受佩戴24 h動態血壓監測儀或24 h有效血壓記錄低于70%者。最終納入患者217例，年齡39～69歲，皆為漢族。

1.2 基本資料

記錄患者的年齡、性別、籍貫、高血壓家族史、用藥史、既往病史、高鹽高脂飲食狀況，入院前每日吸煙的為吸煙者，每周飲酒4次以上為酗酒者。

1.3 血壓晝夜節律和試驗分組

用袖帶式動態血壓監測儀（CB-1304-C型，無錫中健科儀有限公司）測量試驗對象24 h血壓，日間（6：00～22：00）測量間隔30 min，夜間（22：00～次日6：00）測量間隔60 min。夜間血壓下降率計算公式：（日間平均血壓－夜間平均血壓）/日間平均血壓×100%，以夜間血壓下降率在10%～20%定義為杓型節律。非連續日測定2次，2次血壓晝夜節律類型一致的納入試驗。以杓型節律為正常節律對照組，以非杓型或超杓型節律為異常血壓晝夜節律試驗組。

1.4 基因多態性檢測

取2 mL靜脈血，DNA抽提取試劑盒提取DNA，按序列引物序列（見表1）用PCR儀（MJ PTC-100型，美國）擴增ADRB2、NEDD4L基因相應片段。PCR反應總體積60 μL，2×Bench TopTM Tap Master Mix 30 μL，上游引物和下游引物各2.4 μL，模板DNA 3 μL，加滅菌蒸餾水至60 μL。反應條件為94℃ 預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產物送北京華大基因測序，檢測ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601的SNP多態性。

表1 ADRB2和NEDD4L的引物Tab 1 PCR primer of ADRB2 and NEDD4L gene

1.5 統計分析

采用SPSS 22.0軟件?；举Y料值采用均數±標準差表示，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗確定試驗對象的人群代表性。非條件Logistic 回歸分析確定高血壓患者異常血壓晝夜節律的獨立危險因素，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本資料對比

納入試驗組138例，對照組79例，兩組患者高血壓家族史、高鹽飲食、吸煙、酗酒等因素差異無統計學意義，但年齡、ADRB2rs1042713位點攜帶A等位基因、ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601都攜帶A等位基因的Both-A-allele在試驗組的分布高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者基線資料比較Tab 2 Baseline of dipper and non-dipper hypertensive patients

2.2 ADRB2、NEDD4L基因型

經基因測序分析，ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601在試驗對象中均存在野生型（G/G型）、雜合型（G/A型）和突變型（A/A型）（見圖1）。

圖1 ADRB2（rs1042713）、NEDD4L（rs4149601）基因測序圖譜Fig 1 DNA sequencing of ADRB2（rs1042713）and NEDD4L（rs4149601）

對各基因型在試驗對象中的分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗（見表3），結果表明ADRB2、NEDD4L基因多態性分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），說明樣本有群體代表性。

表3 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗Tab 3 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test of ADRB2 and NEDD4L

2.3 影響高血壓晝夜節律的因素

用非條件單因素Logistic回歸分析基因型與血壓晝夜節律的相關性（見表4）。結果表明，ADRB2rs1042713位點攜帶A等位基因、ADRB2rs1042713和NEDD4Lrs4149601都攜帶A等位基因的Both-A-allele可能是異常血壓晝夜節律的危險因素。排除混雜因素，將篩選出的這些危險因素進行多因素Logistic回歸分析，篩選出異常血壓晝夜節律的獨立危險因素，結果見表5。Both-A-allele以及高齡是異常血壓晝夜節律的獨立危險因素。

表4 影響血壓晝夜節律單因素Logistic回歸分析Tab 4 Univariate Logistic regression analysis of blood pressure circadian rhythm in hypertensive patients

表5 影響血壓晝夜節律多因素Logistic 回歸分析Tab 5 Logistic regression analysis of blood pressure circadian rhythm in hypertensive patients

3 討論

目前對血壓晝夜節律的定義以夜間血壓下降率為標準，夜間血壓下降率在10%～20%為杓型，＜10%為非杓型，＞20%為超杓型[10-11]，其中非杓型和超杓型都屬于異常血壓晝夜節律。異常血壓晝夜節律不僅是高血壓的易感因素，也是高血壓導致靶器官損傷的獨立危險因素[12]，夜間血壓下降率每降低5%，心血管死亡風險就會降低18%[13]。高齡是異常高血壓晝夜節律的獨立危險因素（OR＝1.976，95%CI1.368～2.854，P＝0.008），表明高血壓晝夜節律異常隨著年齡增加逐漸發生，與文獻報道[14]的結果一致。

自主神經功能異常是血壓晝夜節律異常的主要原因之一。交感神經分別作用于心臟和血管的腎上腺素能β1和β2受體調節血壓。ADRB1基因多態性是β受體阻滯劑作用差異的原因之一[15]，ADRB2基因多態性的研究則更多地集中于血壓調節和對高血壓易感因素的影響[16]，所以本試驗不納入正在使用β受體阻滯劑的高血壓患者。一項隊列研究發現ADRB2（rs17778257和rs2400707）攜帶A等位基因與夜間血壓杓型節律改變有關[3]，但本試驗沒有發現ADRB2rs1042713基因多態性（攜帶A等位基因OR＝2.333，95%CI0.879～6.191，P＝0.089）導致的血壓晝夜節律異常。

血壓晝夜節律還與體液因素相關。上皮鈉通道是鈉離子重吸收的限速通道，對血壓調節有關鍵作用。泛素連接酶NEDD4L的WW結構域與上皮鈉通道的β亞基和γ亞基產生泛素化作用，加速腎鈉重吸收而導致血壓升高[17]。NEDD4L基因多態性是體位性低血壓的易感因素[18]，表明NEDD4L基因變異可致血壓調節異常。鈉排泄的特點是白天高夜間低[19]，限鈉不僅可以降低血壓，還可以使血壓晝夜節律由非杓型轉變為杓型[4]，由此推斷NEDD4L基因多態性可能與血壓晝夜節律相關。本試驗沒有發現單獨的NEDD4Lrs4149601多態性對高血壓晝夜節律有顯著影響，但與ADRB2rs1042713多態性交互作用后，在兩個基因都攜帶A等位基因的情況下，高血壓患者的異常血壓晝夜節律比例顯著增加（OR＝12.293，95%CI2.712～55.710，P＝0.001），說明在神經因素和體液因素的共同作用下，異常高血壓晝夜節律更加顯著。