格拉司瓊貼劑在巴馬香豬中的相對生物利用度

胡冰瑩，韋陽，孫瑩瑩，陳姍姍（杭州醫學院藥學院，浙江省神經精神疾病藥物研究重點實驗室，杭州 310013）

格拉司瓊（granisetron）是一種強效高選擇性外周和中樞神經系統5-羥色胺3受體拮抗劑，可拮抗上端小腸腹部向心神經纖維和孤束核或嘔吐化學感受區上的5-羥色胺3受體，從而預防和治療化療及放療等引起的惡心和嘔吐[1]。與其他止吐藥相比，格拉司瓊具有效應高、選擇性高且毒性低等特點，是臨床止吐首選藥之一[2]。

臨床上，格拉司瓊制劑以片劑和注射劑為主[3]。口服格拉司瓊因首過效應明顯，絕對生物利用度僅為60%，且個體間藥代動力學差異很大，消除半衰期和總的血漿清除率有10倍以上的差異[4]。而注射劑的劑型特點限制了其使用。

貼劑為透皮給藥系統，能避免肝臟的首過效應和藥物在胃腸道的降解，藥物吸收過程中的個體差異較口服給藥小，且患者依從性好，能突破格拉司瓊口服制劑和注射劑的多種局限[5-7]。美國食品藥品監督管理局于2008年批準了首個用于控制化療患者惡心與嘔吐的格拉司瓊透皮貼劑（SANCUSO）且已有該藥的藥代動力學研究報道[8-10]。國產格拉司瓊透皮貼劑的相關研究較少，僅有少量三天制劑[11-12]和六天制劑[13]的藥代動力學數據，七天制劑的藥代動力學研究尚未見報道。

巴馬香豬是中國特有的一種實驗用小型豬，其皮膚的解剖學結構及生理學特性都與人類的皮膚極為相似，適宜于在皮膚相關研究中作為動物模型使用[14]。本研究以巴馬香豬為動物模型，以SANCUSO為參比制劑，測定國產鹽酸格拉司瓊七天透皮給藥貼劑的藥代動力學特性，評價其相對生物利用度。

1 材料

1.1 儀器

液質聯用系統（安捷倫1100雙泵、安捷倫1100脫氣儀、安捷倫1100自動進樣器；AB SCIEX API3000質譜儀，Analyst 1.4工作站）。Allegra X-15R離心機（貝克曼）；AE100電子分析天平（梅特勒）；多管渦旋器（Cole-Parmer 4721-00）；超低溫冰箱（海爾）；移液器（Eppendorf）。

1.2 試藥

格拉司瓊對照品（含量：99.8%，批號：100558-200602）和鹽酸雷莫司瓊對照品（含量：99.5%，批號：100662-201202）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚和醋酸銨均為色譜純（美國TEDIA公司）；超純水由Millipore超純水儀制備。格拉司瓊七天透皮給藥貼劑（受試制劑，河南羚銳制藥股份有限公司研制，規格為每52 cm2含藥34.3 mg，批號：20130809）；格拉司瓊透皮貼劑（SANCUSO，參比制劑，ProStrakan公司，七天制劑，規格為每52 cm2含藥34.3 mg，批號：40282）。

1.3 實驗動物

巴馬香豬[江蘇泰州泰和生物科技有限公司，生產許可證號為SCXK（蘇）2011-0002]。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流動相為有機相（30%甲醇-70%乙腈）∶水相（pH為4.1的12.5 mmol·L－1醋酸銨緩沖液）＝75∶25（V/V）；流速0.5 mL·min－1；進樣量25 μL；柱溫45℃。

2.2 質譜條件

離子源：Turbo Ionspray源；掃描方式：多反應監測（MRM）；正離子模式；源溫度：400℃；離子噴霧電壓：5000 V；格拉司瓊的定量離子對為m/z313.1→m/z138.1，去簇電壓為85 V，碰撞能量為40 eV；內標（IS）雷莫司瓊的定量離子對為m/z280.1→m/z121.0，去簇電壓為65 V，碰撞能量為30 eV。

2.3 溶液配制

精密稱取格拉司瓊對照品兩份，用甲醇溶解并制成1.0 mg·mL－1的格拉司瓊對照品儲備液和質控儲備液。用甲醇梯度稀釋對照品儲備液得0.15、0.5、2.5、10、50、100、200 ng·mL－1的格拉司瓊標準工作溶液；用甲醇梯度稀釋質控儲備液得0.15、0.25、25、150 ng·mL－1的格拉司瓊質控工作溶液。

精密稱取鹽酸雷莫司瓊對照品溶解于適量甲醇中，制成1.0 mg·mL－1的儲備液，并用甲醇稀釋制備25 ng·mL－1的內標工作溶液。

配制的溶液均于4℃保存。

2.4 樣品處理

血漿室溫下融化，渦旋10 s后，3000 r·min－1離心5 min，取0.5 mL上清液至已加入10 μL內標工作溶液的離心管中，加入100 μL 2 mol·L－1的NaOH，渦旋30 s混勻，加入5 mL甲基叔丁基醚，渦旋2 min，3000 r·min－1離心5 min。將離心管置于－80℃冷凍下層水相后約10 min，將上層有機相轉移至干凈離心管中，40℃條件下氮氣吹干，加入100 μL流動相渦旋1 min，即得樣品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 取6份不同批次的空白血漿、定量限（LOQ，0.003 ng·mL－1）樣品和巴馬香豬使用受試制劑24 h后樣品（1.42 ng·mL－1），按“2.4”項下方法處理后進樣。典型色譜圖見圖1，可見空白血漿中的內源性物質不干擾格拉司瓊和內標雷莫司瓊的測定，方法專屬性良好。

圖1 格拉司瓊和內標的典型色譜圖Fig 1 Representative chromatogram of granisetron and IS

2.5.2 標準曲線 精密移取格拉司瓊標準工作溶液10 μL和490 μL空白血漿，混勻，制成質量濃度分別為0.003、0.01、0.05、0.2、1、2、4 ng·mL－1的格拉司瓊標準血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后進樣。以血漿中格拉司瓊和內標的質量濃度比為橫坐標，以格拉司瓊和內標的峰面積比為縱坐標，采用加權（1/χ）最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.41x＋0.0115（r＝0.9999），線性范圍為0.003～4 ng·mL－1。

2.5.3 精密度和準確度 精密移取格拉司瓊質控工作溶液10 μL和490 μL空白血漿，混勻，制備4個質量濃度水平的質控樣品，分別為定量限濃度質控（LOQ，0.003 ng·mL－1）、低濃度質控（LQC，0.005 ng·mL－1）、中濃度質控（MQC，0.5 ng·mL－1）和高濃度質控（HQC，3 ng·mL－1）。質控樣品按“2.4”項下方法處理后進樣，考察方法的日內及日間精密度（RSD）和準確度。結果見表1，表明該方法的精密度和準確度良好。

表1 格拉司瓊分析方法的精密度和準確度Tab 1 Precision and accuracy of analytical method for granisetron

2.5.4 基質效應 取6個不同批次的空白血漿，按“2.4”項下方法進行萃取，將有機相轉移至已分別加入10 μL 3個質量濃度水平的格拉司瓊質控工作溶液和10 μL內標工作溶液的離心管中，40℃條件下氮氣吹干，加入100 μL流動相渦旋1 min，進樣25 μL。峰面積記為B。另取490 μL水代替490 μL空白血漿，重復以上操作，每個質量濃度平行做6份，峰面積記為A。B/A的值即為基質因子，并用內標的基質因子對格拉司瓊的基質因子進行歸一化。結果表明，在LQC、MQC和HQC 3個質量濃度的質控樣品中，格拉司瓊的內標歸一化基質因子分別為97.50%、125.20%和122.99%，且6個不同批次血漿間LQC、MQC、HQC 3個質量濃度的質控樣品中內標歸一化基質因子的RSD分別為13.0%、6.0%和5.6%。

2.5.5 提取回收率 取LQC、MQC和HQC 3個質量濃度的質控樣品，按“2.4”項下方法處理后進樣，每個質量濃度平行做5份，峰面積記為C。與“2.5.4”中用同一批空白血漿制備的樣品峰面積B計算比值C/B，即為提取回收率。結果表明，在LQC、MQC和HQC 3個質量濃度質控樣品中格拉司瓊的提取回收率平均值分別為81.75%、89.76%、93.21%，RSD分別為12.6%、5.0%、5.9%，內標的提取回收率平均值為86.53%，RSD為12.0%。

2.5.6 穩定性考察 取LQC、MQC和HQC 3個質量濃度質控樣品，在室溫下放置3 h、凍融3次和－80℃放置60 d后，按“2.4”項下方法處理后進樣。結果見表2，表明格拉司瓊在以上條件下均有良好的穩定性。取LQC、MQC和HQC 3個質量濃度質控樣品，按“2.4”項下方法萃取，在自動進樣器中放置12 h后分析測定。結果見表2，表明格拉司瓊在該條件下穩定性良好。

表2 格拉司瓊的短期穩定性、凍融穩定性、長期穩定性和處理后樣品穩定性(n＝3)Tab 2 Matrix stability and processed sample stability of granisetron (n＝3)

2.5.7 稀釋可靠性 配制6 ng·mL－1格拉司瓊血漿樣品，吸取100 μL該溶液到離心管中，再加入400 μL空白血漿，混勻，按“2.4”項下方法處理后進樣，樣品平行做6份。結果表明，樣品經稀釋5倍后測定結果的準確度為102.08%，RSD為5.4%。

2.6 藥代動力學及生物利用度

2.6.1 給藥方案 6月齡的健康巴馬香豬10只，雌雄各半，體質量（15.20±1.98）kg，實驗期間正常飲食。在給予貼劑前一日，將上腹部毛發剃干凈，給藥前再剃一次，應保證皮膚不被創傷。

采用區組隨機、兩周期、自身交叉、單次給藥的實驗設計方法，將10只巴馬香豬分為兩組，每組5只。第一組先給予格拉司瓊透皮貼劑受試制劑，后給予參比制劑，第二組給藥順序相反。每次給藥時間為7 d，兩次給藥時間間隔為17 d。給藥劑量均為0.626 mg·kg－1，即0.9552 cm2·kg－1。

2.6.2 血漿樣品采集測定 在給藥前及給藥后6 h、12 h、24 h、d2、d3、d4、d5、d6、d7（移去貼劑前及移去貼劑后4 h、8 h和12 h）、d8、d9、d10和d11于豬前腔靜脈叢取血3 mL。血樣置于肝素抗凝管中并混勻，3000 r·min－1離心5 min，分離血漿，分成兩份（每份不少于0.5 mL），－80℃冷凍待測。待測樣品按“2.4”項下方法處理后測定。計算平均血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。

圖2 10只巴馬香豬使用受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時間曲線圖Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of 10 bama miniature pigs after the administration of test preparation（rhombus）and reference preparation（square）

2.6.3 貼劑藥物殘留量測定 格拉司瓊貼劑在巴馬香豬使用7 d后，取下貼劑由河南羚銳制藥完成貼劑藥物殘留量測定，經測定殘留藥物占給藥量的1.68%～66.01%。

2.6.4 藥代動力學參數計算 使用DAS 2.1.1軟件計算藥代動力學參數，其計算原理如下：取可檢測到藥物的最后3～5個時間點質量濃度的自然對數，對相應時間t進行線性回歸，求得末端相消除速率常數λ；半衰期t1/2＝0.693/λ；tmax和Cmax取實測值；用梯形法求算藥-時曲線下面積AUC0～t值；AUC0～∞＝AUC0～t＋Ct/λ（Ct為末次可測樣本的血藥濃度）。結果見表3。

表3 巴馬香豬使用受試制劑及參比制劑的主要藥代動力學參數Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of bama miniature pigs after the administration of test preparation and reference preparation

2.6.5 統計分析及生物利用度計算Cmax、AUC0～t和AUC0～∞運用多因素方差分析，tmax運用非參數檢驗進行分析。相對生物利用度F（%）＝（AUC0～∞受試/AUC0～∞參比）×100%。

交叉給予受試制劑和參比制劑格拉司瓊透皮貼劑后，巴馬香豬體內的tmax、Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等藥代動力學參數差異無統計學意義（P＞0.05）。受試制劑相對參比制劑的F為102.3%。表明兩種制劑的吸收消除過程相似。

3 討論

巴馬香豬分別交叉給予受試制劑和參比制劑格拉司瓊透皮貼劑后，藥物經皮吸收較好。血藥濃度在給藥12 h后達到峰值，隨后開始下降，但在給藥2 d內均可維持在一個較高的濃度水平。給藥7 d后撤藥，撤藥后血藥濃度逐步降低，撤藥4 d后（即給藥11 d）血藥濃度已低于檢測方法的LOQ（0.003 ng·mL－1），這一現象在受試制劑和參比制劑之間并無明顯差異，推測不會對藥代動力學參數和生物利用度結果產生顯著影響。

使用兩種制劑后的t1/2、tmax、Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等藥代動力學參數均無顯著差異，表明兩種制劑的一致性較高，但給藥后個體間的代謝特征差異較大。受試制劑Cmax均值為1.658 ng·mL－1（變異系數CV為72.5%），AUC0～∞均值為2.962 ng·d·mL－1（CV為58.0%）；參比制劑Cmax均值為1.693 ng·mL－1（CV為87.2%），AUC0～∞均值為2.918 ng·d·mL－1（CV為47.1%）；而根據參比制劑的產品說明書，其臨床試驗Cmax的均值為5.0 ng·mL－1（CV為170%），AUC0～168h均值為 527 ng·h·mL－1（CV為173%），同樣表現出個體差異較大的特征。此外，藥物殘留量也表現出較大差異（1.68%～66.01%），但同一給藥個體使用兩種制劑后的藥物殘留量具有較好的一致性，且AUC0～∞和藥物殘留量也表現出一定相關性，藥物殘留量較少的個體相對具有較大的AUC0～∞。