基于響應面法的五行香草方揮發油提取工藝研究和體外抑菌作用評價

閆紅敏，于蘭蘭*，郭子燕（.河南省直第三人民醫院藥學部，鄭州 450000；.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450000）

五行香草方是本院中醫專家在《備急千金要方》中避溫病方“粉身散”的基礎上以加減，經大量臨床實例總結出的治療腳氣病的外用方，取得了較好的療效，該方由川芎、藁本、白芷、防風、細辛組成，可作用于足底特殊穴位，對腳氣、腳臭、骨刺等有顯著的治療作用[1]。該方的有效成分多為揮發性成分，揮發油又是中藥“辛”味的重要物質基礎，也是該類中藥發揮治療作用的主要物質基礎之一，即中藥“辛”味與揮發油、表證和炎癥關系密切[2-3]，且揮發油分子量小、脂溶性較強，容易穿過體內生物膜，生物利用度高，能快速吸收起效[4]。在前期的臨床觀察中，將中藥粉通過一定的工藝制成中藥鞋墊使用，制作工藝復雜、重復利用率低，本實驗擬通過優選工藝提取五行香草方中的揮發油，并通過體外抑菌實驗觀察其抑菌效果，為進一步改進工藝、優化劑型提供依據。

1 材料

1.1 儀器

揮發油提取器（北京新科實驗室玻璃儀器有限公司），2015年版《中國藥典》藥典篩（浙江上虞市道墟五四儀器廠），DT-400電子天平（北京醫用激光儀器廠常熟分廠），FW-600高速萬能粉碎機、MH3000電子調溫電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

白芷（批號：B712191-01）、川芎（批號：B810103-01）、防風（批號B710304-01）（河北楚風中藥飲片有限公司），細辛（批號：170701，湖北聚瑞中藥飲片有限公司），藁本（批號：1707005，江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司），經河南中醫藥大學第一附屬醫院陳天朝主任藥師鑒定，符合《中國藥典》各品種項下規定。細菌培養基血瓊脂平板（批號：20191010B）、真菌培養基為沙保羅培養基（批號：20191007B）（安圖生物科技有限公司）。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（批號：A0291B，廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心）；白假絲酵母菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌均由河南省直第三人民醫院檢驗科臨床分離所得。

2 方法與結果

2.1 提取方法

稱取100 g五行香草方全粉，過篩，加入適量蒸餾水，置于圓底燒瓶中，常壓加一定量蒸餾水，室溫下浸泡一定時間，連接揮發油提取器，提取一定時間，收集提取物，并加適量石油醚（60～90℃）萃取。精密讀取揮發油體積，計算其提取率，提取率（%）＝提取量（mL）/全粉質量（g）×100%。

2.2 單因素實驗

查閱文獻[5-7]，分別設置粉末等級、浸泡時間（h）、提取時間（h）、液固比4個因素，每個因素設置5個水平，以揮發油提取率為指標對影響因素進行初步篩選。

2.2.1 粉末等級 選擇浸泡時間2 h，提取時間3 h，液固比12∶1，考察粉末等級為原飲片、最粗粉（粒徑70～13 μm）、粗粉（粒徑29～9.9 μm）、中粉（粒徑9.9～7.6 μm）、細粉（粒徑7.6～6.6 μm）時對五行香草方揮發油提取率的影響，結果見圖1A。

圖1 各因素對五行香草方揮發油提取率的影響Fig 1 Effect of various factors on the extraction rate of volatile oil in Wuxing vanilla formulae

當粉末等級由飲片至粗粉時，揮發油提取率呈明顯的上升趨勢；粉末等級為粗粉時，揮發油提取率達到峰值；當粉末由中粉到細粉時，五行香草方的揮發油提取率呈現下降趨勢。粉末等級從粗粉至細粉時，五行香草方的揮發油提取率逐漸減低，這是由于粉末過細，置于圓底燒瓶中沸騰提取揮發油時容易糊化，影響揮發油提取率，故粉末等級以粗粉為宜。

2.2.2 浸泡時間 選擇粉末等級為粗粉，提取時間為3 h，液固比為12∶1，考察浸泡時間為0、1、2、3、4 h對五行香草方揮發油提取率的影響，結果見圖1B。隨著浸泡時間的增加，揮發油提取率呈明顯的上升趨勢，至2 h后趨于平衡，3、4 h時揮發油提取率無明顯上升。故浸泡時間以2 h為宜。

2.2.3 提取時間 選擇粉末等級為粗粉，浸泡時間為2 h，液固比為12∶1，考察提取時間為1、2、3、4、5 h對五行香草方揮發油提取率的影響，結果見圖1C。隨著提取時間的延長，揮發油提取率呈現上升趨勢；當提取時間為3 h時，揮發油提取率達到峰值，延長時間提取率無明顯上升，故提取時間以3 h為宜。

2.2.4 液固比 選擇粉末等級為粗粉，浸泡時間為2 h，提取時間為3 h，考察液固比為6∶1、9∶1、12∶1、15∶1、18∶1對五行香草方揮發油提取率的影響，結果見圖1D。當液固比為6∶1、9∶1時，該方的揮發油提取率無明顯變化；當液固比為12∶1時，揮發油提取率呈明顯上升趨勢；當液固比為15∶1、18∶1時，揮發油提取率呈現略微的下降趨勢。故選擇液固比12∶1為宜。

根據上述單因素試驗結果，初步篩選的較優的提取條件為粉末等級為粗粉、浸泡時間2 h、提取時間3 h、液固比12∶1。最終選擇浸泡時間1～3 h，提取時間3～5 h，液固比為9∶1～15∶1進行響應面設計，優化五行香草方的揮發油提取工藝。

2.3 Box-Behnken響應面法優化揮發油提取工藝

選取浸泡時間（X1）、液固比（X2）、提取時間（X3）為考察變量，揮發油提取率（Y）為響應值，采用Box-Behnken design（BBD）實驗設計方案[8]，進行三因素三水平的響應面分析對工藝參數進行優化，設計17組實驗點。因素與水平表見表1，實驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平表Tab 1 Factor and level

表2 Box-Behnken響應面法實驗設計與結果Tab 2 Design and results of Box-Behnken response surface method

應用Design Expert軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到Y對X1、X2、X3之間的二次多項回歸方程為Y＝1.44＋0.11X1＋0.045X2＋0.041X3－0.0025X1X2＋0.025X1X3－0.018X2X3－0.076X12－0.054X22－0.091X32；剔除不顯著項后Y＝1.44＋0.11X1＋0.045X2＋0.041X3＋0.025X1X3－0.018X2X3－0.076X12－0.054X22－0.091X32。由方程可知，各因素對方中揮發油提取率的影響大小排序為X1＞X2＞X3，即浸泡時間＞液固比＞提取時間。對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。

從表3可以看出該模型P＝0.0007＜0.001，說明該響應面回歸方程模型顯著；且模型失擬項P＝0.0704＞0.05不顯著，說明方程對實驗擬合較好。模型中X1、X2、X3、X12、X22、X33項具有顯著性，表明各個自變量與因變量間的線性關系較為明顯，對各因素繪制曲面圖和等高線圖，更能直觀地反映各因素對響應值的影響以及最優條件下各因素的取值結果，詳見圖2。

圖2 各因素對五行香草方揮發油提取率的曲面圖和等高線圖Fig 2 Surface plot and contour map of various factors to extraction rate of volatile oil in Wuxing vanilla formulae

表3 Box-Behnken響應面法方差分析Tab 3 Variance analysis of Box-Behnken response surface method

根據Box-Behnken響應面法實驗所得結果和二次多項回歸方程，采用Design Expert軟件擬合可得最優工藝條件為浸泡時間2.39 h，液固比14.36∶1，提取時間4.30 h，在此條件下得到的揮發油得率為1.50%。

為驗證結果的可靠性，平行精密稱定五行香草方3份，每份100 g，對模型優化的工藝進行驗證。考慮到實驗的可操作性與便捷性，選擇工藝參數浸泡時間為2.5 h、液固比14∶1、提取時間4 h對3批樣品進行提取工藝驗證，計算揮發油提取率，求其平均值為1.51%（RSD＝0.77%，n＝3），與理論預測值基本吻合。

2.4 五行香草方揮發油抗菌活性測定

2.4.1 揮發油的提取 按“2.3”項下優化方法提取白芷、川芎、防風、細辛、藁本及五行香草方中的揮發油。

2.4.2 抑菌片的制備 取無菌干燥、直徑為6 mm的濾紙片，每片滴加揮發油30 μL浸潤，然后將濾紙片平放于無菌培養皿中，置于室溫下干燥后備用；另取同樣無菌干燥、直徑為6 mm的濾紙片，每片滴加滅菌水30 μL，干燥后作為對照無菌片；在無菌條件下，用接種環分別挑取一環金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌接入研缽中，以少量生理鹽水進行研磨，直至均勻，即得供試菌懸液[9]。

2.4.3 抗菌活性的測定 采用濾紙片法測定揮發油的抑菌圈[10]。精密吸取各供試菌懸液100 μL分別涂布于相應的培養基平板上；在無菌操作下，每種揮發油均取3片抑菌片和1片對照無菌片貼放在相應菌液的固體培養基平板上并將對照無菌片置于平板中心。實驗菌群為金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌時，在37℃恒溫條件下培養24 h；實驗菌為紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌時，在26℃恒溫條件下培養7 d，重復3 次，觀察結果，并計算出抑菌環的平均直徑，結果見表4。

表4 不同揮發油抑菌實驗(±s，n＝3)Tab 4 Antibacterial test of different volatile oils (±s，n＝3)

表4 不同揮發油抑菌實驗(±s，n＝3)Tab 4 Antibacterial test of different volatile oils (±s，n＝3)

注（Note）：對照無菌片無抑菌作用（The control sterile tablets had no antibacterial effect）。

供試液抑菌環直徑/mm金黃色葡萄球菌白假絲酵母菌紅色毛癬菌石膏樣小孢子菌細辛揮發油11.2±0.268.9±0.3312.7±0.1210.1±0.09白芷揮發油6.3±0.167.1±0.437.3±0.086.6±0.26防風揮發油8.5±0.367.3±0.148.9±0.099.3±0.22川芎揮發油6.2±0.146.3±0.146.2±0.056.5±0.37藁本揮發油6.8±0.098.0±0.346.8±0.227.2±0.14五行香草方揮發油10.9±0.089.1±0.1813.5±0.2912.7±0.24

結果表明，五行香草方中各飲片提取的揮發油對金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌均有抑制作用，抑菌效果為金黃色葡萄球菌：細辛＞五行香草方＞防風＞藁本＞白芷＞川芎；白假絲酵母菌：五行香草方＞細辛＞藁本＞防風＞白芷＞川芎；紅色毛癬菌：五行香草方＞細辛＞防風＞白芷＞藁本＞川芎；石膏樣小孢子菌：五行香草方＞細辛＞防風＞藁本＞白芷＞川芎。

3 討論

中藥揮發油是從芳香中藥中提取出來的一類化學成分復雜、藥理活性廣泛的油狀液體[11]，本實驗中提取的中藥復方揮發油的抑菌強度強于單味中藥飲片，表明復方配伍對抑菌效果有一定的增效作用。且前期研究表明，方中諸藥均有不同程度的抑菌抗菌作用[12-20]，復方抑菌作用強于單味中藥，說明方中各藥味間存在明顯的協同作用，中藥復方配伍對揮發油的化學成分和含量存在一定的影響。若要進一步闡明抑菌物質基礎，可對該復方進行更為深入的GC、GC-MS研究，分析單味藥與復方揮發性成分的組成及含量，為五行香草方的抑菌效果提供確切的理論依據，為后期的劑型優化提供物質基礎。