Box-Behnken響應面法優化芍藥甘草湯的提取工藝

劉蕾蕾，劉冬涵，張紫薇，畢嘉謠，鐘宛凌，杜守穎，白潔（北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488）

芍藥甘草湯出自東漢名醫張仲景所著《傷寒論》，收錄于國家中醫藥管理局公布的第一批《古代經典名方目錄》，方由白芍、炙甘草組成，是仲景為誤汗亡陽，陽復后的腳攣急證而設[1]，目前，對芍藥甘草湯的研究多集中在藥理作用機制及臨床應用方面，尚未見其有關其現代制劑工藝的研究報道。

根據規定，在經典名方現代制劑的開發過程中，必須以物質基準為核心抓手，保證現代制劑和傳統湯劑質量屬性的一致性[2]。提取工藝的參數優化不是以轉移率為目標，而是通過關鍵質量屬性保證提取物與物質基準的一致性[3]。用現代提取工藝開發制劑，調整工藝參數使其與古方用砂鍋煎煮湯液的關鍵質量屬性一致，是本試驗的重點。

芍藥甘草湯物質基準的關鍵質量屬性包括芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量，出膏率和指紋圖譜相似度。質量標準是一個范圍，響應面法可以通過給定的響應值范圍確定在該范圍內的因素水平，因此本文選擇響應面法對其制劑工藝進行優化。首先確立物質基準的質量標準，然后選一批對應的飲片進行提取工藝的考察，以指標性成分含量和出膏率的綜合評分為指標，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化提取工藝，使提取液與物質基準對應實物的關鍵質量屬性保持一致。

1 儀器與試藥

JM-B10002電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；BSA 224S電子分析天平、MC京制00000246號電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；KQ5200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Thermo Fisher U3000 高效液相色譜儀[DAD檢測器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達圣科技有限公司）；G20型醫用離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；FD-2A型真空冷凍干燥機（北京博醫康試驗儀器有限公司）。

白芍飲片（浙江磐安縣，批號：20190801～20190805；四川中江，批號：20190901～20190905）和炒甘草飲片（自炮）經北京中醫藥大學劉春生教授分別鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia.lactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。

芍藥苷（批號：110736-201842，含量：97.4%）、甘草苷（批號：111610-201607，含量：93.1%）、甘草酸銨（批號：110731-201720，含量：97.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher，色譜級）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 物質基準制備

稱取白芍55.20 g、炒甘草55.20 g，加飲用水600 mL，武火煮沸轉文火煎煮65 min（按古方考證之后的煎煮方式），300目尼龍篩網濾過，濾液放冷至室溫，精密移取10 mL藥液至30 mL西林瓶中，凍干72 h（冷凝器溫度－86℃，樣品溫度－40.9℃，真空4 Pa），取出加塞壓蓋，即得物質基準對應實物。

2.2 物質基準特征圖譜方法的建立

2.2.1 色譜條件 Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～6 min，95%B；6～10 min，95%→88%B；10～19 min，88%→85%B；19～25 min，85%→81%B；25～30 min，81%B；30～40 min，81%→75%B；40～50 min，75%→60%B；50～60 min，60%→50%B；60～65 min，50%→95%B）；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進樣體積為5 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取芍藥甘草湯物質基準凍干粉1支，精密移取5 mL水復溶，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，離心濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 精密度考察 取同一份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定其指紋圖譜，圖譜導入《中藥指紋圖譜相似度計算軟件》（2012版本）進行分析，計算圖譜之間的相似度，結果均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性考察 取同一批次供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件平行進樣，測定其指紋圖譜，計算圖譜之間的相似度，結果均大于0.99，表明該法測定的重復性良好。

2.2.5 穩定性考察 取同一份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣測定，計算不同圖譜之間的相似度，結果均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.6 16批物質基準指紋圖譜研究 將10批白芍（浙江磐安5批、四川中江5批）與10批炒甘草（內蒙古鄂爾多斯）飲片隨機組合，按“2.1”項下方法制備16批物質基準，取物質基準凍干粉樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，得HPLC指紋圖譜，見圖1。對色譜圖進行全譜峰匹配，相似度在0.939～0.998，相似度良好，說明物質基準制備工藝穩定。

圖1 16批芍藥甘草湯物質基準指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 16 batches of Shaoyao Gancao decoction substance benchmark

2.3 物質基準中芍藥苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 采用Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）等度洗脫；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進樣體積為5 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品15.05 mg置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到質量濃度為 2.93 mg·mL－1的對照品母液。將對照溶液母液用甲醇稀釋，分別配制成質量濃度為0.14、0.36、0.90、1.50、1.88、2.35 mg·mL－1的芍藥苷對照溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取凍干粉約0.3 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，甲醇溶解后超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.3.4 方法學考察 根據2020年版《中國藥典》[4]分析方法驗證指導原則，按“2.3.1”項下色譜條件進行芍藥苷含量測定的方法學考察。結果表明儀器精密度、供試品溶液穩定性（24 h內）、重復性、加樣回收率及方法專屬性均良好（見表1及圖2）。

2.3.5 物質基準中芍藥苷的含量 取16批芍藥甘草湯物質基準樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，每批平行3份，取平均值，結果見表2，芍藥苷含量在0.54%～1.00%，均值為0.77%。

2.4 物質基準中甘草苷、甘草酸的含量測定

2.4.1 色譜條件 采用Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）梯度洗脫（0～8 min，86%B；8～15 min，86%→82%B；15～20 min，82%B；20～35 min，82%→50%B；35～36 min，50%→0%B），流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為237 nm；柱溫為30℃；進樣體積為5 μL。

2.4.2 甘草苷、甘草酸混合對照品溶液的制備精密稱定甘草苷20.17 mg、甘草酸銨23.05 mg，置10 mL量瓶中，70%乙醇溶解并定容，即得含甘草苷1877.83 μg·mL－1、甘草酸2206.31 μg·mL－1的混合對照品母液。精密移取混合對照品溶液母液，用70%乙醇稀釋，分別配制一系列質量濃度的甘草苷、甘草酸對照溶液，測定峰面積，繪制標準曲線。

2.4.3 供試品溶液的制備 取凍干粉約0.3 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，加入70%乙醇，超聲處理30 min，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.4.4 方法學考察 根據2020年版《中國藥典》[4]分析方法驗證指導原則，按“2.4.1”項下液相條件進行甘草苷、甘草酸含量測定的方法學考察。結果表明儀器精密度、供試品溶液穩定性（24 h內）、重復性、加樣回收率及方法專屬性均良好（見表1及圖2）。

表1 芍藥甘草湯物質基準中指標成分含量測定的方法學考察Tab 1 Methodology on determination of index components in substance benchmark of Shaoyao Gancao decoction

圖2 芍藥苷（A）和甘草苷、甘草酸（B）專屬性測定色譜圖Fig 2 Chromatogram of specificity determination of paeoniflorin（A）and liquiritin and glycyrrhizinic acid（B）

2.4.5 物質基準甘草苷、甘草酸的含量 取16批芍藥甘草湯物質基準樣品，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，每批平行3份，取平均值，結果見表2。結果表明16批物質基準中甘草苷含量在0.45%～0.75%，均值為0.60%，甘草酸含量在0.38%～0.64%，均值為0.51%。

表2 16批物質基準指標性成分含量測定及出膏率結果Tab 2 Content of index components and dry extract rates of 16 batches of substance benchmark

2.5 物質基準出膏率測定

精密移取煎煮后藥液100 mL，轉移至已知重量的蒸發皿中，60℃減壓干燥，稱重，計算出膏率。公式為出膏率＝m/M×100%，式中m表示干膏粉的質量，M表示飲片初始質量（方重），結果見表2。16批物質基準的出膏率在15.37%～21.07%，均值為18.35%。

2.6 提取液各指標的測定

稱取白芍55.20 g、炒甘草55.20 g，置于合適圓底燒瓶中，加入一定體積的飲用水回流提取，300目尼龍篩網濾過，放冷至室溫，飲用水補足體積，精密移取水液3 mL至10 mL離心管中，10 000 r·min－1離心5 min，取上清液進樣。測定芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量及出膏率。

2.7 單因素試驗初步篩選提取工藝

為盡可能客觀地反映各個因素對芍藥甘草湯提取工藝的影響，擬采用綜合加權評分法，將各個指標以綜合評分（OD）的形式進行考察，對綜合評分進行直觀分析[5-6]。各指標的權重系數均為0.25，綜合評分（OD）＝0.25×（芍藥苷含量＋甘草苷含量＋甘草酸含量＋出膏率）

根據文獻[7-10]和實際經驗，以綜合評分為指標，選定提取時間（0.5、1、1.5、2、3 h）和加水倍量（5、10、15、20倍）進行單因素考察，結果如圖3所示。可以看出隨提取時間加長，綜合評分逐漸增加，提取2 h后評分增加漸緩，所以將響應面提取時間高水平定為2 h；加水倍量在5～20倍時，綜合評分隨加水量的增大而增加，加水至20倍時超出物質基準70%～130%的綜合評分范圍，所以將加水倍量高水平定為15倍。

圖3 各因素對綜合評分的影響Fig 3 Effect of various factors on the comprehensive score

2.8 Box-Behnken 法優化芍藥甘草湯提取工藝

按照 Box-Behnken試驗設計基本原理，在前期單因素試驗結果的基礎上，優化選取加水倍量（A）、提取次數（B）和提取時間（C）3 個影響因素，以芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量及出膏率的綜合評分為評價指標，根據 Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，設計3因素3水平17個試驗點的響應面分析，其中12個析因點，5個中心點，試驗設計因素及水平見表3。

表3 響應面試驗設計因素及水平表Tab 3 Factor and level

2.8.1 Box-Behnken試驗結果 根據Box-Benhnken試驗設計方案進行試驗，每組平行3次，結果見表4。

表4 Box-Behnken 試驗設計及結果Tab 4 Box-Behnken design and results

2.8.2 模型的建立與顯著性檢驗 采用 Design-Expert 10 軟件對結果進行模型擬合，擬合分析結果見表5，由結果可知有兩個模型的擬合結果的P值均小于0.05，根據有多個擬合模型結果顯著時，選擇最高階多項式模型的原則，故而選擇二階多項式模型進行方程擬合。

表5 多種模型擬合分析Tab 5 Multiple model fitting analysis

對擬合模型進行ANOVA方差分析，由表6可知，回歸方程使用的模型P＜0.05，表明此模型有效可靠。失擬項是用來表示模型與試驗擬合的程度，本次模型的失擬項P值為0.3766＞0.05，表明該模型無失擬因素存在，模型與實際值能較好地擬合。模型相關系數R2＝0.9357，說明該模型能解釋93.57% 響應值的變化；調整決定系數adj-R2＝0.8531，說明可信度較好，可以運用該模型分析。回歸方程為：綜合評分＝0.93＋0.055A＋0.19B＋0.039C－0.025AB＋0.022AC＋0.046BC－0.017A2－0.10B2－0.066C2。

表6 回歸模型方差分析結果Tab 6 ANOVA of the regression model

該模型中，因素A、B、B2的P＜0.05或P＜0.001，表明加水倍量和提取次數對綜合評分的影響較顯著，各因素對綜合評分的影響順序為提取次數＞加水倍量＞提取時間。此外，各影響因素之間還存在交互作用。不同交互因素與綜合評分的響應面分析見圖4。圖4A及圖4B的響應面圖坡度較陡，表明加水倍量與提取次數時間、提取次數與提取時間交互作用較強，對綜合評分的影響顯著，圖C 的響應面圖坡度平緩，表明加水倍量與提取時間的交互作用較弱，對綜合評分的影響較小。

圖4 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖和等高線圖Fig 4 Response surface and contour plot of interactive effect on the comprehensive score

2.8.3 優選工藝的預測與驗證 采用Design-Expert 10軟件對提取工藝進行優化，根據物質基準標準的70%～130%質量離散范圍，將各指標范圍均定離散范圍內，綜合評分的范圍限制為高為0.362，低為0.670，得到最優工藝預測為加水5.134倍，提取1.016次，提取時間為0.555 h，此條件下計算的理論綜合評分為0.510。為方便實際試驗操作，將最佳工藝調整為加水5倍，回流40 min提取1次，驗證提取工藝的可行性。

經過3次驗證試驗測得的芍藥苷、甘草苷、甘草酸單處方含量均值分別為0.61%、0.61%、0.64%，出膏率均值為17.68%，綜合評分為0.508，與響應面法預測值相接近，同時也在物質基準標準的70%～130%的離散范圍內，3次驗證試驗指紋圖譜的對照圖譜（S1）與物質基準標準的對照圖譜（S2）相似度比較結果為0.997（見圖5），均符合質量要求。

圖5 芍藥甘草湯物質基準（S2）與驗證試驗（S1）圖譜Fig 5 Chromatogram of the substance benchmark（S2）and verification experiment（S1）of Shaoyao Gancao decoction

3 討論

物質基準的質量控制包括指標性成分含量、特征圖譜相似度以及出膏率3個指標，前期考察發現藥材的產地與批次差異對湯劑的指紋圖譜影響不大，同時17次響應面試驗的指紋圖譜相似度均大于0.95，所以綜合評分的設立不包括指紋圖譜相似度，只需驗證試驗時與物質基準對應實物的相似度。

在綜合評分的比例分配上，由于本方只有兩味藥材，包含3個指標性成分，均在藥典考察之列，所以重要程度相當，同時因為出膏率會影響后續制得顆粒的服用量，所以綜合評分設立了4個指標，每個指標占比相同。

在單因素試驗的設計上，結合經驗與文獻初步篩選影響芍藥甘草湯提取工藝的因素，發現加水倍量、提取時間、提取次數3個因素對含量和出膏影響較大，故而將這3個因素作為響應面的設計因素。此外一般提取次數增加到一定程度時，藥材中的有效成分已基本提取完全，再增加提取次數也難以使成分含量有較大改變[11]。所以直接將提取次數3個水平設定為1、2、3次。

響應面法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法，可有效減少試驗次數，并可直觀體現影響因素之間的交互作用[12]。通過響應面法優選提取工藝時，軟件給出的最優工藝在實際生產中并不能實現，綜合考量之后將加水量定為5倍，同時延長了提取時間變為40 min，而芍藥苷具有熱不穩定性[13]，可能是導致實際獲得芍藥苷比預測值偏低的原因，而甘草苷、甘草酸含量以及出膏率都與最佳工藝預測值相當，表明響應面法預測的可靠性。直觀分析里第12組響應面試驗綜合評分為0.50，與預測的0.51也較接近，但可能由于加熱時間太長使得芍藥苷含量減少低于物質基準標準范圍，所以舍棄。考慮到后續顆粒劑的質量，對提取液濃縮干燥后的干膏粉進行了含量測定，也在物質基準范圍內，在確定了提取這個對含量影響最大的工藝后，后續可以通過略微調整濃縮干燥工藝進一步調整干膏粉的含量，以確保最終得到的制劑與芍藥甘草湯劑質量一致。應用響應面法優化法得到的芍藥甘草湯提取工藝穩定可靠，與物質基準質量一致，可以作為后續顆粒劑的提取方法。