黃連總生物堿與三七皂苷組合物對大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷的影響

王曉，劉博，張譯心，2，王鑫，周赫，2，紀鳳蘭，丁濤，溫富春，徐惠波*（.吉林省中醫藥科學院，長春 3002；2.長春中醫藥大學藥學院，長春 307）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是糖尿病患者最主要的大血管并發癥，發病率高達55%[1]，也是患者死亡的首要原因。由于糖尿病前期與冠心病早期發病均無明顯癥狀，導致診斷不及時，臨床在確診糖尿病時往往已經存在并發冠心病，或在確診冠心病時已經存在糖耐量異常或胰島素抵抗等糖尿病前期癥狀。也正因如此，對于糖尿病合并冠心病的治療常常將二者割裂開來，按單一疾病或根據出現的合并癥狀對癥治療。

黃連為多年生毛茛科草本植物黃連的根莖，主要活性成分為生物堿，其中小檗堿的降糖作用一直是討論熱點，而除小檗堿外的其他生物堿也具有降糖作用[2]。三七總皂苷是三七的主要活性成分，可通過調控氧化應激[3]、改善血管內皮功能[4]等多種途徑改善糖尿病及其并發癥[5]。我們的前期研究提示[6]，黃連總生物堿與三七總皂苷組合物（簡稱HS組合物）對糖尿病及糖尿病冠心病大鼠模型具有較好的藥理活性，本實驗以前期實驗結果為基礎，通過建立鏈脲佐菌素結合冠狀動脈結扎制備的大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型研究其對于糖尿病冠心病的影響，旨在充分利用中藥多途徑、多靶點的特點，從多方面針對糖尿病合并心肌損傷發揮治療作用，為其進一步的研究與開發提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體質量190～230 g，SPF級[遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證號：211002300041542]。實驗動物均于屏障系統中飼養，溫度濕度恒定，每12 h明暗交替，動物均自由進食飲水。本實驗系通過吉林省中醫藥科學院動物倫理委員會批準后實施，倫理審批號為JLSZKYDWLL 2018-003。

1.2 試藥

HS組合物[黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖，黃連提取物其含量以小檗堿計不得小于60%，批號：20180101。三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖，三七提取物其含量以人參皂苷Rg1計不得小于68%，批號：20180501。將提取物376.5 g與三七提取物36 g，加輔料制得HS組合物]（吉林省中醫藥科學院新藥中心化學實驗室自制）；鹽酸二甲雙胍片（白云山湯陰東泰藥業有限責任公司，批號：180706）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號：WXBC7268V）；SDSPAGE凝膠制備試劑盒（批號：20410）、高靈敏度化學發光檢測試劑盒（批號：20405）、RIPA Lysis Buffer（批號：30427）、SDS-PAGE Loading Buffer（批號：40320）、Protease inhibitor Cocktail（批號：50321）、Tris-Glycine SDS Buffer（批號：30310）、Tris-Glycine Transfer Buffer（批號：40439）、Multicolor Protein Marker（批號：30312）、TBST（批號：40439）（康為世紀生物科技有限公司）；Bax（貨號：SC-7480）、Bcl-2（貨號：SC-7382）、Caspase-3（貨號：SC-65497）、Caspase-1（貨號：SC-392736）、IL-1β（貨號：SC-515598）、GAPDH（貨號：SC-365062）（Santa Cruz）；NOX2（博奧森，貨號：bs-3889R）；NOX4（博奧森，貨號：bs-4730R）；NLRP3（Abcam，貨號：Ab214185）；山羊抗兔IgG H＆L（HRP）（Abcam，貨號：Ab205718）。

1.3 儀器

BGM506型血糖儀（中國深圳家康科技有限公司）；PB-10型pH計[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；CS-600B型全自動生化分析儀（中國長春迪瑞實業有限公司）；ELx800型酶標儀（美國Bio Tek公司）；Leica EG 1130型修切冷臺、RM2255型高精密全自動切片機、Leica EG1140型石蠟包埋機（德國Leica公司）；PowerLab/8S型多導生物記錄儀（ADInstruments公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；FB-40型血液凝固分析儀（中國山西亞森實業有限公司）；NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統（日本NIKON公司）；BX51 OLMPUS型光學顯微鏡（日本OLMPUS公司）；HC-3618R型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；ChemiDoc-It 510 Imager型凝膠成像系統（Ultra-Violet Products Ltd）。

2 方法

2.1 造模與給藥

雄性Wistar大鼠適應性喂養7 d，隨機分為對照組（n＝16）與造模組（n＝54），將兩組大鼠禁食12 h，造模組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）55 mg·kg－1（溶于pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，在配制后30 min內注射完畢），對照組大鼠則注射等體積溶劑（10 mL·kg－1），造模組大鼠注射STZ 2周后禁食12 h，尾靜脈采血檢測大鼠血糖，將空腹血糖＜11.1 mmol·L－1的未成模大鼠剔除。

根據血糖與體質量均衡原則將成模大鼠分為模型組（n＝20）、二甲雙胍組（200 mg·kg－1，n＝14）、HS組合物組（黃連總生物堿865 mg·kg－1＋三七總皂苷84 mg·kg－1，根據前期研究[6]以及預實驗結果確定組合物比例，n＝15）。分組后每日灌胃給藥1次，連續15周。末次給藥1 h后，以1.2 g·kg－1劑量腹腔注射烏來糖麻醉大鼠，將其仰位固定于手術臺上，切開頸部進行氣管插管，并連接呼吸機進行機械通氣，以八道生理記錄儀持續觀察并記錄大鼠心電圖。于左胸第四、五肋間處切開胸壁，并沿胸骨左緣2 mm處切開第四肋骨，擠出心臟，進針于左心耳下緣2 mm處，穿過左冠狀動脈前降支下心肌部分，于肺動脈圓錐左緣出針，在穿線后將心臟放回至胸腔，靜置10 min，待大鼠心電圖顯示T波恢復后，進行冠狀動脈結扎，以ECGⅡ導聯顯示心電圖ST段明顯提高作為冠脈結扎成功的標志，造成大鼠心肌缺血。于心肌缺血30 min后，再次開胸，剪開結扎線以恢復冠狀動脈血流，時間為2 h，對照組除不進行冠狀動脈結扎外，與模型組相同操作。實驗結束后大鼠腹主動脈取血用于各項指標檢測。

2.2 血糖值檢測

每4周各組大鼠禁食12 h，尾靜脈采血并以血糖儀測量空腹血糖。

2.3 口服糖耐量試驗

于試驗結束前，將大鼠禁食12 h，以2 g·kg－1劑量灌胃葡萄糖，血糖儀檢測葡萄糖灌胃0、30、60、120 min時血液中葡萄糖濃度，并繪制血糖濃度曲線，計算大鼠血糖濃度曲線下面積（area under the curve，AUC）。

2.4 血清胰島素含量檢測

參照試劑盒說明書，使用ELISA試劑盒測定大鼠血清中胰島素含量。

2.5 血清氧化應激指標檢測

參照試劑盒說明書，檢測血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量。

2.6 血清心肌酶檢測

參照試劑盒說明書，使用全自動生化分析儀檢測血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。

2.7 胰腺、心肌組織病理變化的觀察

取大鼠胰腺、心臟固定于10%甲醛溶液中，進行常規石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察胰腺組織與心肌組織的病理學變化。

2.8 蛋白表達檢測

稱取－80℃冷凍保存的大鼠心肌組織300 mg，剪碎后加裂解液勻漿，冰浴靜置20 min，4℃條件下于12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度，loading buffer處理蛋白后加樣，進行SDS-PAGE電泳、轉膜及封閉。經過一抗、二抗孵育顯色后置于凝膠成像儀中，觀察結果并拍照，應用VisionWorksLS軟件分析灰度值進行半定量分析。

2.9 統計方法

以SPSS 22.0軟件進行統計分析，表中所有數據均以（±s）表示，單因素方差分析（Oneway ANOVA）法進行多組間比較，當P＜0.05時，表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 HS組合物對大鼠空腹血糖值的影響

與對照組比較，模型組大鼠0～16周期間血糖水平明顯升高（P＜0.001）；與模型組相比，二甲雙胍組大鼠血糖值于第8周（P＜0.05）、第12周（P＜0.001）明顯降低；HS組合物組大鼠血糖值于第4周（P＜0.01）、第8周（P＜0.05）、第12周（P＜0.05）均顯著降低。表示HS組合物對糖尿病大鼠的高血糖有一定的改善作用。結果見表1。

表1 HS組合物對大鼠血糖值的影響(±s，mmol·L－1)Tab 1 Effect of HS compound on fasting blood glucose in rats (±s，mmol·L－1)

表1 HS組合物對大鼠血糖值的影響(±s，mmol·L－1)Tab 1 Effect of HS compound on fasting blood glucose in rats (±s，mmol·L－1)

注：與對照組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

組別初始第4周第8周第12周第16周n血糖值n血糖值n血糖值n血糖值n血糖值對照組16 5.88±0.4216 5.85±0.3416 6.36±0.4614 5.86±0.5514 5.73±0.47模型組2020.90±2.40###2030.81±2.99###2031.37±2.70###1829.99±2.80###1821.91±7.22###二甲雙胍組1420.93±4.741429.67±3.871428.48±3.96*1424.52±3.22***1419.47±7.37 HS組合物組1520.77±3.121525.46±5.73**1527.27±5.39*1525.64±7.15*1322.92±6.50

3.2 HS組合物對大鼠口服糖耐量的影響

與對照組相比，模型組在灌胃葡萄糖0～120 min各時間點大鼠血糖均顯著升高（P＜0.001），AUC明顯增加（P＜0.001）；與模型組相比，二甲雙胍組于葡萄糖灌胃后30、60、120 min血糖降低（P＜0.001），AUC明顯降低（P＜0.001），HS組合物組60、120 min血糖均降低（P＜0.05）。提示HS組合物能一定程度地降低糖尿病大鼠口服葡萄糖后血糖AUC，作用可維持至給藥后120 min，對大鼠糖耐量有良好的改善作用。結果見表2。

表2 HS組合物對大鼠口服糖耐量的影響(±s)Tab 2 Effect of HS compound on oral glucose tolerance in rats (±s)

表2 HS組合物對大鼠口服糖耐量的影響(±s)Tab 2 Effect of HS compound on oral glucose tolerance in rats (±s)

注：與對照組相比，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，***P＜0.001.

組別n血糖值/（mmol·L－1）AUC/（mmol·h·L－1）0 min30 min60 min120 min對照組14 5.73±0.47 7.82±0.72 7.54±0.65 7.34±2.0514.67±0.94模型組1821.91±7.22###31.89±3.01###31.46±2.44###28.85±4.14###59.44±5.53###二甲雙胍組1419.47±7.3722.24±7.29***18.78±6.92***14.54±5.27***37.34±11.95***HS組合物組1322.92±6.5030.56±3.4128.52±3.75*25.73±3.06*55.27±6.21

3.3 HS組合物對大鼠生化指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠胰島素、SOD水平明顯降低（P＜0.001，P＜0.05），MDA與CK-MB則顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組相比，二甲雙胍組、HS組合物組大鼠胰島素與SOD水平則明顯升高（P＜0.001，P＜0.05），HS組合物組大鼠血清中MDA與CK-MB含量明顯低于模型組（P＜0.01，P＜0.05），可見HS組合物組給藥可降低大鼠氧化應激水平，使胰島素分泌增加、心肌損傷減輕。結果見表3。

表3 HS組合物對大鼠血清中胰島素、SOD、MDA及CK-MB水平的影響(n＝11，±s)Tab 3 Effect of HS compound on serum insulin，SOD，MDA and CK-MB level in rats (n＝11，±s)

表3 HS組合物對大鼠血清中胰島素、SOD、MDA及CK-MB水平的影響(n＝11，±s)Tab 3 Effect of HS compound on serum insulin，SOD，MDA and CK-MB level in rats (n＝11，±s)

注：與對照組相比，#P＜0.05，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，#P＜0.05，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，P＜0.01，***P＜0.001.

組別胰島素/（mU·L－1）SOD/（U·mL－1）MDA/（nmol·mL－1）CK-MB/（U·L－1）對照組43.95±5.88312.64±47.125.86±1.42 470.19±139.84模型組17.66±4.19###264.81±43.78#7.33±1.32#1259.20±411.06###二甲雙胍組25.77±4.57***307.65±35.25*6.54±1.68 925.53±326.27*HS組合物組30.80±2.77***313.51±52.70*6.00±0.80** 914.01±344.49*

3.4 HS組合物對大鼠胰腺、心肌組織形態學的影響

對照組大鼠胰腺中胰島組織體積較大且結構完整，呈圓形/類圓形分布，胰島細胞胞漿豐富且數量較多；與對照組相比，模型組大鼠胰腺中胰島數量少且分布稀疏，胰島細胞胞漿減少、數量也明顯減少，胰島明顯萎縮；與模型組相比，二甲雙胍組大鼠胰島數目較多，胰島體積較大，胰島數量有增加；HS組合物組大鼠胰島體積較大，且胰島內細胞數量明顯增加，且相比于二甲雙胍組，HS組合物組胰島數量較多（見圖1）。

圖1 HS組合物對大鼠胰腺組織形態學的影響（HE染色，400×）Fig 1 Effect of HS compound on pancreas histomorphology in rat（HE，400×）

對照組動物心臟可見輕微心內膜心肌間質疏松，心肌細胞染色均勻，心肌纖維排列緊密整齊；與對照組相比，模型組大鼠出現了心肌間質疏松水腫，心肌細胞間邊界不清晰、胞漿紊亂且細胞核大小不規則，染色不均，心肌組織發生了明顯的組織學改變；與模型組相比，二甲雙胍組大鼠心內膜心肌組織腫脹、變性程度較輕，心肌受累面積較小，心肌細胞形態改變程度較輕；HS組合物組大鼠心肌染色不均程度較輕、心肌細胞排列較整齊，心肌損傷程度明顯減輕（見圖2）。HS組合物組大鼠胰島組織與心肌組織損傷程度明顯輕于模型組，表明HS組合物具有良好的胰島及心肌組織保護作用。

圖2 HS組合物對大鼠心肌組織形態學的影響（HE染色，400×）Fig 2 Effect of HS compound on myocardial histomorphology in rats（HE，400×）

3.5 HS組合物對大鼠蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠心肌Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）表達顯著提高，B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達則明顯降低；與模型組比較，二甲雙胍組與HS組合物組大鼠心肌中Bax、Caspase-3、NLRP3、NOX2與NOX4等蛋白表達明顯降低，半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）與白介素-1β（IL-1β）有降低趨勢，Bcl-2則明顯升高。由圖3可見，HS組合物能夠上調糖尿病大鼠心肌組織中Bcl-2的表達，降低Bax、Caspase-3、NLRP3、NOX2及NOX4的表達，差異均具有統計學意義，從而體現出其對心肌組織氧化應激及炎癥反應的改善作用。

圖3 HS組合物大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、NOX2、NOX4蛋白表達Fig 3 Expression of Bax，Bcl-2，Caspase-3，NLRP3，Caspase-1，IL-1β，NOX2，and NOX4 protein in the myocardium of HS compound group

4 討論

NADPH氧化酶在心肌缺血與再灌注過程中扮演著重要的角色，可被多種外源性因素激活，如機體的代謝因素、心肌的缺氧、復氧及缺血與再灌注等，是心血管中ROS的主要來源。NADPH氧化酶共有7個亞型，其中NOX2與NOX4是心血管系統中表達的主要亞型，有研究表明，NOX2與NOX4共同參與了糖尿病的大血管病變，粥樣斑塊中可檢測到NOX2與NOX4的高表達，在發生心肌梗死后，NOX2與NOX4在心臟中的水平顯著升高[7]，而本研究中模型組大鼠NOX2和NOX4的表達情況也與其報道一致。NOX2主要于心肌細胞中大量表達，且分布于正常心肌細胞的細胞質中，當發生氧化應激時，NOX2轉移至細胞膜并誘導ROS的產生。NOX4則主要表達于內皮細胞中，對糖尿病冠心病的內皮損傷具有重要意義，它能通過參與血管內皮的收縮舒張、氧化應激與炎癥反應影響動脈粥樣硬化的進展，是內皮細胞中ROS的主要來源。ROS作為NLRP3的重要激活劑，可通過活化NLRP3誘導炎癥反應的發生。NLRP3被ROS激活后，通過Caspase-1大量活化 IL-1β并激活下游信號分子，通過系列信號轉導后引發嚴重的炎癥反應。IL-1β作為重要的炎癥因子常被認為是NLRP3的激活指標。有研究表明，IL-1β與冠狀動脈狹窄程度和病變支數存在正相關。當糖尿病合并冠心病時，長期的高糖環境與動脈粥樣斑塊的形成可造成心肌缺血缺氧，甚至發生心肌梗死導致死亡。

目前，對于糖尿病合并冠心病的治療主要是通過藥物或血運重建手術來恢復血流以保護心肌缺血造成的心肌損傷與壞死，然而在恢復血流的同時，由于心肌復氧導致線粒體功能失調，進一步促進ROS的大量釋放，引起NLRP3的持續激活，致使IL-1β與Caspase-1等異常增加，導致心肌發生細胞凋亡與炎癥性壞死[8]。Bax與Bcl-2屬于Bcl-2家族，在心肌細胞凋亡過程中起重要作用。Bax通過增加線粒體膜的通透性使細胞色素C穿過線粒體膜，激活Caspase-9，從而激活凋亡的執行者Caspase-3，被上游始動子激活后的Caspase-3作用于下游特定的信號分子，使細胞產生一系列的生物形態學改變，最終發生心肌細胞凋亡[9]。Bcl-2則通過抑制線粒體膜的通透性來抑制下游Caspase-3的激活[10]，從而抑制心肌細胞凋亡[11]。

越來越多的研究表明中藥在糖尿病合并心血管疾病方面具有很大的研究價值和開發潛力。配伍是中藥應用最經典的方式，臨床的聯合用藥也提示我們，單一藥物很難從多方面抑制復雜疾病的發生發展。本研究試圖根據傳統中醫藥理論采用黃連總生物堿與三七總皂苷配伍來實現清熱瀉火、散瘀通脈的功效，用于治療糖尿病并發心肌損傷。黃連在糖尿病的研究中一直頗受關注，其有效成分的研究以小檗堿居多[12]，而對于黃連總生物堿報道較少，有研究表明，黃連總生物堿可通過調節炎癥反應、胰島素抵抗、糖脂代謝、胰島細胞功能等多種途徑改善糖尿病[13]。三七作為傳統的活血化瘀藥從古沿用至今，三七總皂苷作為三七的主要活性成分更是應用廣泛[14]，具有調節血脂、改善心臟功能[15]、改善心肌細胞衰老[16]等作用。

本實驗采用兩者配伍，通過STZ結合冠脈結扎建立大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型觀察HS組合物對糖尿病合并冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用。結果表明，HS組合物能降低糖尿病合并冠心病大鼠血糖，提高胰島素水平，改善大鼠口服糖耐量、通過下調NOX2、NOX4、NLRP3以及Bax、Caspase-3的表達，上調Bcl-2蛋白的表達抑制糖尿病心肌缺血大鼠氧化應激與炎癥反應，減輕心肌細胞凋亡，從而改善糖尿病合并冠心病誘導的心肌損傷。目前，小檗堿針對糖尿病治療在臨床已有應用，但仍作為輔助治療聯合其他降糖藥使用，本試驗采用黃連總生物堿與三七總皂苷配伍，在保證降糖效果的同時減輕心肌缺血再灌注引起的氧化應激、炎癥反應，為該品種的開發提供了理論依據。